郝学明，王响铃，宋柏权，王孝纯，王秋红，周建朝

（黑龙江大学/黑龙江省寒地生态修复与资源利用重点实验室/黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室，哈尔滨150080）

0 引言

甜菜(Beta vulgaris)是黎科甜菜属作物，是世界上仅次于甘蔗的第二大重要的糖料作物[1]。甜菜糖占世界食糖产量的30%左右，在世界产糖大国中，中国是美国、日本、埃及、西班牙等少数既产甜菜糖又产甘蔗糖的国家之一[2]。中国甜菜种植主要分布在东北、西北和华北地区，在中国北方农业与制糖业发展和农民增收等方面具有不可代替的作用[3]。甜菜是一种糖料作物，光合作用是甜菜块根产糖量形成的重要影响因素，甜菜块根产量中90%～95%的有机质是由光合作用固定并转化的[4]。植物光合利用率主要取决于叶片叶绿素含量的多少，可以通过测定叶片中的叶绿素含量来鉴定其营养状况[5]。因此，测定甜菜叶绿素含量对分析甜菜叶片光合能力、预测甜菜块根产糖有具有重要意义。

目前测定叶绿素含量的方法主要有2 种，一种是化学提取分光光度计比色法，另一种是SPAD(Soil and Plant Analyzer Development)叶绿素仪法[6]。SPAD-502叶绿素仪可快速测量植物叶片单位面积叶片当前叶绿素的相对含量，即SPAD值[7]。采用叶绿素仪测定叶片的SPAD值具有便携、实时和对叶片无损的优点。在棉花[8]、小麦[9-10]、水稻[11-12]、油菜[13]等作物[14]及果树[15]和园林树木[16]中均有广泛应用。研究表明，叶绿素在植株叶片中的分布会因物种、测定时期、测定位置的不同而异。不同植物及同一植物的不同品种利用SPAD值来预测叶片叶绿素含量均存在一定差异，同一植株叶片上的SPAD值表现出叶尖部＞叶中部＞叶基部的特点[17-18]。而分析甜菜叶片叶绿素含量与SPAD值相关性鲜见报道。

本文利用分光光度计和SPAD叶绿素仪测定不同甜菜品种的叶绿素含量，研究甜菜叶片的叶绿素含量和SPAD值的相关关系，确定适宜的SPAD值测定位置，旨在为SPAD-502叶绿素仪测定法计算甜菜叶片的叶绿素含量提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试甜菜品种‘KWS1197’、‘KWS5145’、‘KWS0143’源于德国 KWS 公司，‘ВETA165’源于美国Вeta公司，4个品种均为二倍体遗传单粒种。

水培用盆为聚乙烯塑料盆(24 cm× 17 cm×16 cm)，水培化学试剂同常规。

1.2 试验设计

水培试验于2018年4月4日—5月16日在国家糖料改良中心/黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室进行。将‘KWS1197’、‘ВETA165’、‘KWS5145’、‘KWS0143’甜菜种子播种于经过180℃高温消毒4.5 h 的蛭石中，浇适量去离子水，进行催芽。1 周后（待甜菜子叶完全展开）4 个品种均选择长势一致的幼苗移入1/4全量营养液中培养。首先用1/4浓度全营养液培养1周，然后用1/2浓度全营养液培养5天，之后全量营养液培养25天进行收获，期间营养液每5 天更换1 次。光照时间为7:30—19:30，每天光照12 h，通气12 h。每品种种植 8 盆，每盆 2 株，共 32 盆，随机区组排列。

1.3 测定指标和方法

1.3.1SPAD值的测定 使用SPAD-502型叶绿素计测定最新完全展开叶片的叶尖、叶中和叶基3 个部位的SPAD值，每部位读取10个值，每片叶共30个值。

1.3.2 光合色素含量的测定 光合色素含量的提取采用乙醇法[19]，在测定SPAD值的叶片相应位置，即叶片的叶尖、叶中和叶基3 个部位分别用直径10 mm 打孔器打孔，取3个圆形叶片，用分析天平称重后放于25 mL试管，用10 mL95%乙醇避光浸泡24 h，浸泡过程中混匀多次，待叶片完全变白后进行比色。光合色素测定采用分光光度法，利用UV-8000A紫外分光光度计，用波长665、649、470 nm分别测量吸光度值，并换算为单位质量叶绿素含量，见公式(1)～(4)。

1.4 数据计算及统计方法

试验数据处理以及部分图表的制作和统计分别利用Excel 2010软件和SPSS 22.0制作

2 结果与分析

2.1 甜菜品种间SPAD值差异分析

如图 1～4 所示，4 个甜菜品种SPAD值存在差异，‘KWS1197’、‘ВETA165’、‘KWS0143’、‘KWS5145’叶片平均SPAD值 ，‘KWS1197’最大 ，‘KWS5145’最小。在同一品种叶片不同测定位置上，‘ВETA165’SPAD值表现出叶基＞叶中＞叶尖的特点，越靠近叶片基部，SPAD值越大。‘KWS0143’则表现出完全相反的特点，即叶尖＞叶中＞叶基，越靠近叶片基部，SPAD值越小。‘KWS1197’、‘KWS5145’2 个品种均是叶中值较小，‘KWS1197’叶片不同测定位置SPAD值趋于稳定。‘ВETA165’、‘ KWS1197’叶基部SPAD值最大，‘KWS5145’和‘KWS0143’则是叶尖SPAD值最大。总体比较甜菜叶片中部的SPAD值与平均值最为接近。SPAD值在甜菜叶片中的分布不仅与测定的位置（叶尖、叶中、叶基）有关，还与测定的甜菜品种有关。

图1 ‘BETA165’叶片SPAD值

图2 ‘KWS1197’叶片SPAD值

图3 ‘KWS5145’叶片SPAD值

图4 ‘KWS0143’叶片SPAD值

2.2 甜菜品种间叶绿素总含量差异分析

如图5～9所示，同一叶片的叶绿素总含量，测量位置不同其含量也有差异。‘ВETA165’与‘KWS5145’趋势一致，均是叶基＞叶中＞叶尖，不同测量位置差异显著。‘KWS1197’叶尖、叶中、叶基叶绿素含量差异较小，趋于平稳。‘KWS0143’叶尖的叶绿素总含量最多，而越靠近叶基部含量越少，从叶尖到叶基含量从1.94 mg/g 下降到1.77 mg/g。而各品种在叶中的叶绿素含量最接近均值，具有一定的代表性，这一规律与不同测量位置的SPAD值一致。在甜菜品种之间叶绿素含量叶存在差异。叶片中叶绿素a 含量、叶绿素b 含量、叶绿素总含量及类胡萝卜素含量均表现一致的趋势 ，‘ВETA165’ ＞‘KWS1197’ ＞‘KWS0143’ ＞‘KWS5145’，这与品种间SPAD值的表现趋势类似。在甜菜叶片中，叶绿素a 含量较高，平均1.38 mg/g，占叶绿素总含量的73%，其次为叶绿素b，而叶片中类胡萝卜素含量较低，平均0.25 mg/g。甜菜叶片中叶绿素含量的分布规律与SPAD值一致，不仅与测定的位置（叶尖、叶中、叶基）有关，而且与测定的甜菜品种有关。

图5 ‘BETA165’叶片不同部位叶绿素总含量

图6 ‘KWS1197’叶片不同部位叶绿素总含量

图7 ‘KWS5145’叶片不同部位叶绿素总含量

图8‘KWS0143’叶片不同部位叶绿素总含量

图9 甜菜不同品种叶片叶绿素含量

2.3 甜菜叶片SPAD值及叶绿素含量相关性分析

如图10所示，甜菜叶片叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总含量及类胡萝卜含量与SPAD值做回归统计分析。甜菜光合色素含量与SPAD值呈正向相关。叶片中叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总含量及类胡萝卜素含量的相关系数分别为0.7208、0.7763、0.7766、0.5704。

图10 甜菜SPAD值与光合色素含量的相关性

不同品种甜菜叶片中光合色素含量和SPAD值均有差异，但是品种之间叶片的SPAD值与光合色素含量的变化趋势整体上保持一致。总叶绿素含量与SPAD值的相关性最高，r=0.7766；叶绿素 a、b 含量与SPAD值的相关性次之；类胡萝卜素与SPAD值的相关性最低，r=0.5704。

3 结论与讨论

采用叶绿素仪测定叶片的SPAD值具有便携、实时和对叶片无损的优点。尤其在大田条件下SPAD-502叶绿素仪可在无损状况下几秒钟内测量植物叶片单位面积叶片当前叶绿素的相对含量，大大提高了效率。SPAD值与叶绿素含量相关性研究在其他作物上已有大量报道[20]，但在甜菜叶片及叶片上适宜的测量部位的研究涉及较少。本试验探讨了甜菜叶片上不同测量部位的SPAD值及相应的叶绿素含量，确定了SPAD值与叶绿素含量的相关性及适宜的测量部位，以便更加准确快速地反映甜菜叶片的叶绿素含量。

在甜菜叶片中，不同品种的SPAD值及叶绿素含量在测量位置上存在差异，‘ВETA165’、‘KWS1197’在叶基部叶绿素含量较高，叶尖较低，而‘KWS5145’、‘KWS0143’在叶尖部叶绿素含量较高，叶基部较低。研究结果表明，甜菜叶片的叶中部最接近平均值，因此，在测定甜菜叶片叶绿素含量与SPAD值时，选取叶中部进行测定具有一定的参考意义。陈琴等[15]对牧草的研究发现，叶中部的SPAD值更接近平均值，可以作为试验牧草SPAD值测定的适宜部位，与本试验结果一致。研究发现甜菜4～6片真叶期后最高叶片的叶片尖部可作为甜菜叶片SPAD值的最适测定部位[21]。潘义宏等[17]对烟叶的研究发现，采用叶绿素仪来测定叶片最佳部位会因品种而异。叶绿素含量在叶片3个部位存在差异可能是植物叶肉组织成熟程度的差异造成的。SPAD值会受到不同品种、不同测定时间、不同的生长环境等因素的影响[6,22-23]。

笔者使用SPAD-502 叶绿素仪测定叶绿素的相对含量，分光光度法测定叶绿素绝对含量，通过对甜菜SPAD值与叶绿素含量比较发现，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素及SPAD值在不同甜菜品种间有一定的差异。同时在甜菜叶片中叶绿素a 含量＞叶绿素b 含量＞类胡萝卜素含量。这一结果与其他研究结果一致[24]。对叶绿素含量与SPAD值进行相关分析发现，SPAD值与叶绿素含量呈正相关，这一结果与水稻、小麦等作物[25]及绿色蔬菜[26]、果树[27]等的研究结果相似。其中总叶绿素含量与SPAD值的相关性最高，r=0.7766，叶绿素a、b含量与SPAD值的相关性次之，而类胡萝卜素与SPAD值的相关性最低，r=0.5704。

综上所述，通过SPAD值来预测甜菜叶片叶绿素的绝对含量是可行的，为叶绿素的快速测定提供了便利，但是SPAD值会受到多种因素的影响，代表的是叶绿素的相对水平，在实际生产中若是要求植株确切的叶绿素含量，还需用传统的分光光度法。而本试验的甜菜品种较少，若测定不同品系的多个甜菜品种其相关性会更加精确。对于SPAD值和不同品种甜菜氮含量、产量、含糖量的关系还待于下一步研究。