李亭玉， 孔 洁， 王 元， 崔明勋， 李艳茹， 李太元

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli简称大肠杆菌)，是肠道内共生菌[1],为单细胞生物呈单个或成对存在[2]，平板计数法和显微计数法是目前较为常见的2种细菌计数方法，平板计数法计数准确，但耗时长，操作复杂；显微计数法所需时间短，操作简单，但计数结果误差较大[3]，大肠杆菌血清型众多、毒力基因和耐药基因复杂[4]，而大肠杆菌的计数常被用于制备生物制品和微生物学实验中，因此，细菌计数方法简单便捷、准确的特点显得尤为重要[5]。

分光光度计，又称光谱仪，是利用1个可以产生不同波长的光源，通过系统分装装置，从而产生指定波长的光源，指定波长的光源透过待测的样本后，一部分光线被样本吸收，并计算出样本的吸光度，也称为样本的OD值，从而转化成样本的浓度。浊度计是利用样本对光进行透射或散射的原理制成的一种测定样本浊度的仪器，当光线投射到样本上，散射光强、入射光强、透射光强的比值和样本浊度存在着一定的相关关系，进而来测定样本的浊度。李林思等[6]研究表明，光合细菌的细菌浓度与其光密度的相关关系显著，本试验通过分光光度法和浊度法探究大肠杆菌菌液的吸光度和浊度与活菌数量之间的关系。

本文对大肠杆菌的常用计数方法进行比较研究，并探究吸光度和浊度与活菌数之间的关系，为大肠杆菌的计数问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

大肠杆菌(Escherichiacoli编号：1.2385)购自中国科学院微生物研究所。

1.1.2 药品与试剂

营养肉汤，琼脂粉(均购自北京奥博星生物技术有限责任公司)等。

1.1.3 仪器

分光光度计(U-1800型)；浊度计(WGZ-2000型)；生物显微镜(BX53型)等。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

试验菌种以平板划线法接种于普通琼脂培养基上，于37 ℃恒温箱培养24 h[7]后，用接种环挑取平板中3～5个菌落，接种于50 mL普通肉汤培养基中，37 ℃培养24 h后，备用，所使用的菌液应现用现配，避免存放时间过长导致细菌死亡，产生误差。

1.2.2 大肠杆菌计数方法的比较

将大肠杆菌原液充分混匀，并等量分装于试管中，用无菌生理盐水分别稀释成4、6、8、10倍，将4个样本的菌液用无菌生理盐水倍比稀释成10-6、10-7、10-8[8]，稀释后每个稀释度的菌悬液取200 μL用无菌涂菌棒均匀涂在普通琼脂培养基上，每个稀释度涂3个平板，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，得到每平皿菌落数为30～300 cfu的菌落，3个平板菌落数取平均值，对菌落进行计数并推算出4个样本中每毫升的活菌数量。

将上述稀释的4个样本用无菌生理盐水倍比稀释成10-2[8]，将稀释后的菌液置于细菌计数板中，使菌液充满计数区，盖上盖玻片，在显微镜下进行细菌计数，计出计数板中4个区域的细菌数，根据公式推算出4个样本菌液每毫升的细菌数量。其公式为:

菌数/cfu·mL-1=每小格平均菌数×稀释倍数÷1/4 000

1.2.3 OD600值和浊度与大肠杆菌活菌数量的线性研究

将细菌计数所稀释的4、6、8、10倍的4个样本作为试验材料，将分光光度计调至ABS单位，用无菌生理盐水调零，在波长为600 nm时检测4个样本的OD值；同上述相同的试验材料，用无菌生理盐水调零，用浊度计检测4个样本的浊度(单位为AUT)。将检测出的4个样本OD600值和浊度与平板计数法所计的大肠杆菌活菌数用Microsoft Excel 2019统计软件进行线性回归分析[9]，探讨大肠杆菌活菌数与其OD600值和浊度是否存在着一定的数量关系。

1.2.4 分光光度计及浊度计的灵敏度测定试验

将细菌原液用无菌生理盐水分别稀释4、6、8、10、12、40、60、80、100、120、1 200倍，用无菌生理盐水调零，采用分光光度计在波长为600 nm时测定细菌原液及各稀释样的OD值[10]；同上述稀释浓度，用无菌的生理盐水调零，用浊度计测量细菌原液及各稀释度样本的浊度[11]。根据数据分析分光光度计及浊度计的灵敏度。

2 结果与分析

2.1 平板计数与显微计数方法的比较

平板计数法计数准确，且所计的细菌均为活菌，但操作繁琐，所需的时间较长；显微计数法操作简单，所需时间短，但准确度较低。2种计数方法同时检测，比较二者的计数结果显示：在2种计数方法中，细菌数量随细菌稀释度的增加呈逐渐减少的趋势，显微计数法所计的细菌数量略比平板计数法的细菌数量多(图1)。

图1 2种计数方法的比较结果Fig.1 Comparison of two counting methods

2.2 OD600值与大肠杆菌活菌数的线性研究

取平板计数所得的活菌数和与其对应的OD600为分析对象，用Microsoft Excel 2019统计软件对所得的数据进行线性回归分析得出，在大肠杆菌菌液OD600值约为0.3～0.65时，OD600值与菌液中活菌数量有相关性(图2)，其线性回归方程为y=27.067 x-4.025，系数为0.998 2。

图2 OD600值与活菌数量之间的线性关系

2.3 浊度与大肠杆菌活菌数的线性研究

取平板计数所得的活菌数和与其对应的浊度为分析对象，用Microsoft Excel 2019统计软件对所得的数据进行线性回归分析，得出在大肠杆菌菌液浊度约为30～90 NTU时，菌液的浊度与活菌数量有相关性(图3)，其线性回归方程为y=0.156 x-0.169，系数为0.998 7。

图3 浊度与活菌数量之间的线性关系

2.4 分光光度计及浊度计的灵敏度测定

将原液分别稀释成11个稀释度，测定原液及各个稀释度的OD600值和浊度。由表1可知，当菌液质量分数在0.008 3以下时，分光光度计已无法检测其OD600值，而浊度仪仍能检测，由此可见，浊度法较分光光度法更加灵敏。由图4、5可知，质量分数在0.025以上时，OD600值随质量分数的升高而升高，具有相关性；当质量分数在0.025以下时，质量分数与OD600值之间发生偏离，由此可得出，当OD600值约在0.034以下时，分光光度计会产生偏差。由图6、7可知，质量分数在0.025以上时，浊度随菌液质量分数的升高而升高，具有相关性；当质量分数在0.025以下时，质量分数与浊度之间有些偏离，由此可得出，当浊度在3.34以下时，浊度法会产生略微偏差，但较分光光度法而言，偏差较小。

表1 OD600值及浊度与质量分数的关系

注：“/”表示仪器无法检测。

图4 质量分数在0.025以上时与OD600值的关系Fig.4 The relationship between OD600 and mass fraction above 0.025

图5 质量分数在0.025以下时与OD600值的关系

图6 质量分数在0.025以上时与浊度的关系Fig.6 The relationship between turbidity and massfraction above 0.025

图7 质量分数在0.025以下时与浊度的关系

3 讨论与结论

在实际生产中，细菌计数是基础且重要的工作，其精确性十分重要。目前，较准确的传统细菌计数方法主要有平板计数法和显微计数法[12]，有研究者发现细菌菌液的吸光度与细菌数量之间有一定的线性关系[13]，因此，该研究对大肠杆菌这几种计数方法进行比较研究，探究吸光度、浊度与大肠杆菌活菌数量之间的关系[14]并研究分光光度法及浊度法的灵敏度。

在相同稀释度下，通过平板计数法和显微计数法对大肠杆菌进行计数，2种计数方法检测的细菌数量有所差异，计数结果显示：显微技术法>平板计数法。平板计数法所计数的均为活菌，但是操作过程繁琐，所需的时间较长；显微计数法操作过程简单，所用时间短，但在显微镜下不容易辨别死亡的细菌。因此，显微计数法所计细菌的数量会偏高。

该试验通过对浊度与活菌数和吸光度与活菌数之间的关系进行比较发现：当大肠杆菌菌液OD600值约在0.3～0.65时，OD600值与菌液中活菌数量有相关性，其线性回归方程为y=27.067 x-4.025；当大肠杆菌菌液浊度约在30～90 NTU时，菌液的浊度与活菌数量有相关性，其线性回归方程为y=0.156 x-0.169，R2>0.99，均呈良好的相关性，测量菌液的吸光度和浊度也可以推算出菌液的活菌数量，是一种简单高效的细菌计数方法。

在分光光度法及浊度法的灵敏性测定试验中[15]，当菌液的质量分数在0.008 3以下时，分光光度计已无法检测其OD600值，而浊度计仍能检测，由此可见，浊度法较分光光度法更加灵敏。当菌液的质量分数在0.025以上时，二者无显著差异，与质量分数均具有相关性，当菌液的质量分数在0.025以下时，OD600值发生较大的偏离，而浊度的偏离程度较小，从而证明浊度法比分光光度法更加精确灵敏。