杨浩博， 王 瑜， 仲 帅， 刘 鑫， 宗成文

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

笃斯越桔(VacciniumuliginosumLinn.)，又称都柿、笃斯、黑豆树、龙果、地果等，杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)多年生落叶灌木，是我国重要的野生浆果资源，主要分布于大、小兴安岭和长白山等地[1-2]。常呈大群落、成片集中分布，与落叶松、越桔、细叶杜香、蔓越桔等植物种混生[3]，具有耐酸性土壤、耐严寒的特性。笃斯越桔果实中含有较多营养成分，特别是有机酸、花青苷、黄酮类化合物等[4]，在提高大脑记忆、减少胆固醇累积、改善心血管机能、抗氧化活性、防止衰老等方面都具有较高的功效。笃斯越桔果实酸甜可口，营养丰富，除可鲜食外还可制果酱、酿酒等[5]。在笃斯越桔的遗传多样性研究方面，Alsos等[6]利用同工酶分析表明笃斯越桔种群内部遗传多样性较低，在物种水平的遗传多样性较低。

DNA条形码是利用一段标准分子片段对生物物种进行识别和鉴定的一项新型技术，根据DNA信息，快速、准确的识别某个物种或发现新物种以及隐存物种[7]。近些年来，国内外学者对适合用于鉴定植物的 DNA条形码基因序列进行了积极的探索与研究，叶绿体psbA-trnH序列是位于psbA和trnH间的1段非编码序列，与编码区基因相比可提供更多的系统发育信息[8]。psbA-trnH基因片段进化速率快，能够积累较多变异，从而能够鉴别亲缘关系很近的物种，因此适宜作为鉴定植物的DNA条形码。

张佳佳等[9]通过分析山药28个不同样品的psbA-trnH序列研究了山药亲缘关系和系统进化关系。李晓娟等[10]采用psbA-trnH序列对山东丹参、丹参 (S.miltiorrhiza) 和白花丹参 (S.miltiorrhizaf. alba) 共计33份材料进行了研究，结果表明psbA-trnH基因间区可作为条形码来鉴定山东丹参及其近缘种。万如等[11]通过DNA条形码技术，以psbA-trnH基因为条形码编码序列对枸杞属植物21份试验材料进行鉴定分析，在分子水平上获得鉴定枸杞属植物的理论依据。

我国越桔属植物资源丰富，分布广泛，对生态环境有较强的适应性，但缺少深入研究[12]，该试验以长白山地区与汪清地区的笃斯越桔为样本，基于psbA-trnH序列与GenBank中其他越桔属植物的psbA-trnH序列进行差异分析，为进一步研究笃越桔属植物的遗传进化和分布奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以5份笃斯越桔叶片为样本，其中，3份采自长白山东方红林场(DNF_1-3)，经度E128°25′60″，纬度N42°01′56″，海拔高度1 270 m，2份采自汪清兰家林场(LJ_1-2)，经度E130°49′52″，纬度N43°25′54″，海拔高度778 m，将新生嫩叶装入标记好的无菌采样袋内，再用干冰进行低温保存，带回实验室后放入-60 ℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 笃斯越桔叶片DNA提取

使用北京华越洋生物技术有限公司的植物总DNA提取试剂盒，对笃斯越桔的新鲜叶片进行DNA提取，DNA提取方法参照试剂盒中的植物总DNA提取说明书，检测合格后保存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 PCR扩增

psbA-trnH引物序列：正向为5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′，反向为5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′，psbA-trnH基因的PCR反应体系(25 μL)为：模板DNA1 μL(80 ng·L-1)；dNTP(2.5 mmol/L)1 μL；上下游引物(10 μmol/L)各1 μL；rTaq酶(5 U/μL)0.2 μL；10×Buffer 1 μL；ddH2O 19.8 μL。根据反应体系设置如下扩增程序：95 ℃预变性5 min；35个循环：94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s；然后72 ℃延伸5 min。最后扩增产物在4 ℃保存。

1.2.3 笃斯越桔psbA-trnH基因的克隆及测序

扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪上观察记录，选取在预期目的基因条带位置出现的单一清晰明亮条带，利用北京华越洋DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的条带，与T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，送至北京三博远志生物工程有限公司进行双向测序。

1.2.4 笃斯越桔psbA-trnH基因的序列分析

将笃斯越桔psbA-trnH基因序列在NCBI的BLAST进行比对，共下载11份越桔属植物psbA-trnH序列，其中包括1份笃斯越桔，1份红豆越桔，1份狭叶越桔，1份鹿莓越桔，1份乌饭树，2份蔓越橘，2份草地越桔，2份欧洲越桔，使用ClustalX1.83软件对越桔属psbA-trnH基因序列进行多序列比对，再使用GeneDoc软件将多序列比对结果输出。

2 结果与分析

2.1 笃斯越桔psbA-trnH基因片段的PCR扩增与测序结果

以提取的的笃斯越桔总DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在500 bp左右出现单一清晰明亮的扩增条带(图1)，回收该条带，送至北京三博远志生物技术公司进行双向测序，结果显示获得了长度为477 bp的笃斯越桔psbA-trnH序列。产物序列与GeneBank的登录号为GU361909的笃斯越桔长度相同。

图1 笃斯越桔psbA-trnH PCR电泳检测结果

2.2 越桔属psbA-trnH基因的多序列比对及遗传距离分析

2.2.1 越桔属psbA-trnH基因的多序列比对

将试验材料测序结果在NCBI上进行BLAST核苷酸序列比对，发现该试验中笃斯越桔psbA-trnH基因与GeneBank中GU361908的欧洲越桔、GU361909的笃斯越桔、GU361911的红豆越桔、GU361910的狭叶越桔、KP643387的鹿莓越桔和KP095224的乌饭树的核苷酸序列一致性都达到了99%，与JQ757046.1的蔓越桔、KP095227的草地越桔和HF572793的欧洲越桔的核苷酸序列一致性达到了98%，与JQ248601的蔓越桔和KP095226的草地越桔的核苷酸序列一致性达到了97%，多序列比对结果如图2所示。

通过多序列比对结果(图2)发现，笃斯越桔试验材料LJ_2在第143位点碱基为C，第359位点碱基为C，笃斯越桔试验材料DFH_2在第251位点碱基为C，笃斯越桔(GU361909)在第309位点碱基为C，说明笃斯越桔种内存在一定的差异。

草地越桔共有3个有效鉴别位点，分别在第36碱基位的碱基为C，在第289碱基位插入了1段TATTCATTTTG碱基序列，在第398碱基位的碱基为T，蔓越桔共有2个有效鉴别位点，分别在第195碱基位的碱基为C，第339碱基位缺失1段TTGAAAATAA碱基序列，狭叶越桔共存在3个有效鉴别位点，分别在第8碱基位点缺失1个碱基，第169位点碱基为T，第428位点碱基为A，乌饭树在第288碱基位为T，红豆越桔在第236位碱基缺失，鹿莓越桔第305位点碱基为T。草地越桔与蔓越桔与其他越桔属植物的碱基序列对比存在明显的差异。

图2 样本序列与越桔属psbA-trnH核苷酸序列多序列比对结果

2.2.2 越桔属psbA-trnH碱基序列组成及长度

运用MEGA5.1分析越桔属psbA-trnH碱基序列组成，16份越桔属植物的G+C值存在着一定差异，为32%～35%，序列长度为400～477 bp。保守位点C(%)为96.3%，变异位点V(%)为3.7%，说明越桔属间变异较小(表1)。

表1 越桔属psbA-trnH碱基序列组成及长度

2.2.3 笃斯越桔与GeneBank中越桔属植物的遗传距离分析

运用MEGA5.1软件内的P-distance算法计算遗传距离(表2)。

表2 基于psbA-trnH序列的越桔属各样本遗传距离

由表2可知，16个越桔属植物psbA-trnH序列遗传距离0～0.013，平均遗传距离为0.005，经统计，120个遗传距离中大于平均遗传距离0.005的有58个，且相互差异较小，实验材料LJ_1与DFH_3、DFH_1、红豆越桔(GU361911)遗传距离为0，与DFH_2遗传距离为0.002，与LJ_2遗传距离为0.004，与笃斯越桔(GU361909)遗传距离为0.002。

2.3 笃斯越桔psbA-trnH基因的系统进化分析

运用MEGA5.1软内的Phylogeny生成Neighbor-Joining系统发育树，对GeneBank中越桔属psbA-trnH基因序列建立的Neighbor-Joining系统进化发育树进行分析。由图3可知，psbA-trnH基因越桔属的系统进化树具有多条分支，其中由笃斯越桔与红豆越桔聚合为1支，蔓越桔、狭叶越桔、乌饭树、欧洲越桔、草地越桔、鹿莓越桔各自聚合为1支，结果表明，笃斯越桔与红豆越桔亲缘关系较近。

图3 基于psbA-trnH序列的越桔属样本NJ系统树

3 讨论与结论

DNA条形码鉴定是利用基因组中1段公认相对较短的序列对物种进行识别鉴定，可有效弥补传统鉴别的局限[13]，由于部分植物种属内形态变异复杂，性状受环境影响大， 往往呈多样性，易对属、组和种类的划分造成影响，DNA条形码技术可快速、准确鉴定出物种，逐渐在植物的分类鉴定中得到广泛应用[14]。随着DNA条形码技术的发展，在植物界的研究范围越来越广，目前有一些应用较多的基因序列，如ITS、matK、rbcL和psbA-trnH等，但仍未达到成熟阶段[15]。该研究利用叶绿体间隔序列psbA-trnH的保守区设计引物，扩增出完整序列片段，并对扩增产物进行序列测定。该研究以长白山东方红林场，与兰家汪清林场的笃斯越桔为试验材料，与GeneBank中的越桔属植物进行比较分析，通过MEGA5.1计算越桔属的遗传距离，以及建立Neighbor-Joining系统发育树。结果显示5个笃斯越桔试验样本与11个GeneBank中的越桔属植物的psbA-trnH序列长度范围为400～477 bp，越桔属的psbA-trnH序列共有13个变异位点，且草地越桔存在碱基序列TATTCATTTTG的插入、蔓越桔存在碱基序列TTGAAAATAA缺失。越桔属遗传距离的范围为0.000～0.013，平均遗传距离为0.005，笃斯越桔的种内平均距离小于越桔属的平均遗传距离。对越桔属Neighbor-Joining系统发育树分析得出，16个越桔属植物的系统发育树具有两组分支，其中1组分支由笃斯越桔与红豆越桔、鹿莓越桔聚合为1支，再与蔓越桔与狭叶越桔、乌饭树聚为合1支，另一组分支由欧洲越桔与草地越桔聚合为1支，笃斯越桔与红豆越桔亲缘关系较近。由于近些年笃斯越桔被不断地研究开发，市场上出现了一些假冒产品来迷惑消费者，其中黑加仑是外观与笃斯越桔相近的一种小浆果，常有商贩通过贩卖黑加仑欺骗消费者来获取高额利润，更有商家通过加工成商品让消费者无法通过外观辨别真假，通过越桔属的psbA-trnH基因序列与GeneBank中黑加仑psbA-trnH基因序列进行对比分析，两者序列存在明显差异，所以依据psbA-trnH序列的差异不仅可以鉴定亲缘关系较远的越桔属植物，也可以鉴别出假冒笃斯越桔的商品，同时为进一步研究越桔属植物的进化与分布奠定基础。