安晓丽， 孙浩丁， 车成来， 李美兰， 廉美兰*， 朴炫春

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133002；2.延边朝鲜族自治州农业科学院，吉林 龙井 133400)

紫松果菊(Echinaceapurpurea)又称为紫锥花和紫锥菊。隶属于菊科, 紫松果菊属,为多年生草本植物,富含松果菊苷及多糖、多酚等生物活性物质,药用价值极高,具有较强的抗氧化能力[1-2],预防骨质疏松[3],增强对常见感冒病症的抵抗力[4],抗炎与免疫调节[5],对慢性和季节性URI的症状有显著缓解作用[6],也具有潜在的美白作用。

黑色素有着独特的组织结构,作为紫外线吸收剂,它能够抵抗辐射,调节体温,且可在遗传中决定人体肤色等[7]。然而,国内外临床研究发现,由于黑色素过量或色素沉积过多而引发的疾病较多,因此,研究与黑色素形成相关的酪氨酸酶活性的抑制作用就显得尤为重要。酪氨酸酶对于黑色素合成具有促进作用,而过量会导致人体内的色素累积,从而引发相应的病症。对于因黑色素累积而引发的斑点以及暗沉等疾病,可以通过提高酪氨酸酶抑制率的方式来进行医治。目前,市场上较为常见的化妆品和美白剂等护肤产品均含有一些酪氨酸酶抑制剂[8]。贾朝等[9]在柿子叶成分分析的试验中,证实了柿叶中含有可以抑制酪氨酸酶活性的成分,使其具有较高的美白功效;柴晶党等[10]研究中得出，熟地黄具有使酪氨酸酶抑制率显著提升的成分,使其作为一种天然的植物源护肤增白剂。经过国内外的研究发现,利用植物提取物所含的天然成分来抑制酪氨酸酶活性,从而达到控制黑色素的方法显得更加优良,在达到美白效果的同时,也无不良影响[11]。经研究发现,常用的美白化妆品主要以抑制酪氨酸酶的活性进而抑制黑色素的生成以达到美白的功效。酪氨酸酶是人体黑色素形成的关键酶[12],而植物中的酚类物质具有抑制酪氨酸酶活性，减少皮肤黑化、雀斑等的作用,因此多被应用于美白产品研发领域;黄酮类化合物是天然的抗氧化剂,在清除人体内超氧阴离子、降血凝、抗衰老、增强免疫力等很多方面都具有良好的生理活性[13-14],从而在美白护肤、阻止色素沉着等方面起到显著作用;植物中的多糖具有吸湿保湿、抗氧化、延缓衰老、修复组织、抗炎抗菌、抗辐射、美白等多种功效,从而做到全面护肤美肤[15],此外,还具有抗肿瘤、抗疲劳及降血糖等作用[16-17]。该试验以生物反应器培养的紫松果菊不定根为试验材料,探究了不同提取时间、提取温度、提取次数和料液比对酪氨酸酶活性的抑制作用,筛选出最佳提取工艺,并测定该条件下不定根提取物中总酚、黄酮及多糖的含量,对紫松果菊影响酪氨酸酶活性进行了研究与探讨,为紫松果菊不定根提取物抑制黑色素形成的深入研究及美白产品开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

参照王洪秋等[18]的方法对紫松果菊不定根进行增殖。取不定根28 g,将其切成1 cm左右,接种于含有4 L培养基的5 L气球型气升式生物反应器内,培养基为3/4 MS+吲哚丁酸(IBA)1 mg/L+蔗糖50 g/L,pH值为5.8，通气量75 mL/min,培养温度25 ℃。暗培养30 d后进行收获,将收获后的不定根用水冲洗3次,去除表面水分后,放入45 ℃的烘干箱中烘干至恒重,烘干后的不定根干品作为该试验材料。

1.2 试验设计

1.2.1 紫松果菊不定根提取物浓度对酪氨酸酶活性抑制的影响

称取紫松果菊不定根干粉1 g放置在三角瓶内,加入80%的乙醇,料液比(不定根干品重/g∶提取溶剂体积/mL)调为1∶30,采用超声法(频率40 kHz)提取。在50 ℃下提取3次,滤液合并后于旋转蒸发仪上真空浓缩至膏状,获得提取物。浓缩的提取物用磷酸盐缓冲液溶解后,配制不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL),调查不同提取物浓度对酪氨酸酶活性抑制率的影响。

1.2.2 紫松果菊不定根料液比对酪氨酸酶活性抑制的影响

取1 g紫松果菊不定根干粉,浸泡在浓度为80%的乙醇溶液中,料液比分别设置为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50。在50 ℃下超声提取3次,提取时间为2 h。提取物经真空浓缩后,配制成0.8 mg/mL,测定提取物对酪氨酸酶活性抑制率的影响。

1.2.3 紫松果菊不定根提取次数对酪氨酸酶活性抑制的影响

取1 g不定根干粉,浸泡在浓度为80%的乙醇溶液中,料液比为1∶40。在50 ℃下超声提取,提取次数分别设置为1、2、3、4和5次,提取时间为2 h。其它方法同试验1.2.2。

1.2.4 紫松果菊不定根提取温度对酪氨酸酶活性抑制的影响

取1 g不定根的干粉,浸泡在浓度为80%的乙醇溶液中,料液比为1∶40,用超声法提取2次。提取温度分别设置为20、30、50、70和90 ℃,提取时间为2 h。其它方法同试验1.2.2。

1.2.5 紫松果菊不定根提取时间对酪氨酸酶活性抑制的影响

取不定根干粉1 g,浸泡在80%的乙醇溶液中,料液比为1∶40。在50 ℃下超声法提取2次,每次提取时间分别设置为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h。其它方法同试验1.2.2。

1.2.6 正交试验设计

依据单因素试验所得结果,以紫松果菊不定根提取物对酪氨酸酶活性抑制率为指标,设计4因素3水平L9(34)正交试验(表1),进一步确定最佳提取工艺。

表1 正交试验因素水平

根据筛选出的最佳提取条件进行验证试验, 重复3次,确定最佳提取工艺是否稳定。

1.2.7 紫松果菊不定根提取物中活性物质成分

紫松果菊不定根在料液比1∶50,提取次数2次,提取温度30 ℃,提取时间1.5 h的条件下进行提取后,测定紫松果菊不定根提取物中总酚、黄酮和多糖活性物质的含量。

1.3 测定方法

1.3.1 紫松果菊不定根提取物中主要活性物质含量的测定

1) 总酚含量的测定 紫松果菊不定根提取物中总酚含量测定,参考Wu等[19]实验方法,称取0.2 g紫松果菊不定根提取物用80%甲醇溶解并定容至25 mL,精密吸取0.4 mL,加入1.6 mL甲醇稀释后，按标准曲线操作。标准曲线制作方法如下：精确密称取没食子酸25 mg,80%的甲醇溶液定容至250 mL,用移液枪吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL没食子酸溶液,添加80%甲醇溶液至2 mL,每个试管中分别加入0.1 mL 2 mol/L的福林-酚试剂,静置6 min后加入5 mL 20% Na2CO3溶液,暗处理1 h,摇匀后在760 nm处测量OD值。

2) 黄酮含量的测定 不定根提取物中黄酮含量测定参考李培源等[20]实验方法,称取0.2 g紫松果菊不定根提取物,用80%甲醇溶解并定容至25 mL,取0.1 mL于试管中,加入1.9 mL 80%的甲醇溶液,按标准曲线操作,重复3次。标准曲线制作方法：精密称取儿茶素0.04 g,加蒸馏水定容至50 mL,标准曲线浓度为0.8 mg/mL,然后分别取0.19、0.38、0.56、0.75、0.94、1.13、1.31、1.50 mL标准溶液和0.25 mL萃取液于试管中,加蒸馏水至1.5 mL,蒸馏水作为空白对照,再加入0.75 mL 5% NaNO2溶液,摇匀静置6 min后,加入0.15 mL 10% AlCl3溶液,待反应5 min后加入0.5 mL 1 M NaOH溶液,在510 nm处用紫外分光光度计测定其吸光值OD。

3) 多糖含量测定 不定根提取物中多糖含量的测定参考阴婉婷等[21-22]的方法,称取0.1 g紫松果菊不定根提取物，用蒸馏水溶解并定容至100 mL,取0.05 mL用蒸馏水稀释至1 mL,按标准曲线操作。将葡萄糖于110 ℃下烘干4 h,精密称取100 mg,用蒸馏水定容至100 mL,得到浓度为1 mg/mL葡萄糖标准溶液,分别取0.1、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5 mL葡萄糖溶液,蒸馏水定容至10 mL,分别吸取1 mL葡萄糖溶液于试管中,加入1.5 mL 5%苯酚溶液,5 mL浓硫酸,摇匀后静置30 min,在波长为490 nm处用紫外分光光度计测量OD值。

1.3.2 酪氨酸酶活性抑制率的测定方法

参考Chan等[23]的方法,并作了相应的修改。具体为：根据表2依次加入紫松果菊不定根提取物溶液、磷酸盐缓冲溶液(pH值6.8)和L-多巴溶液(1 mmoL/L),将其置于96孔酶标板中,温室培育10 min后,加入50 U/mL蘑菇酪氨酸酶溶液,37 ℃恒温箱中反应5 min后于450 nm处用酶标仪测定吸光值(OD),并按下式计算出酪氨酸酶活性的抑制率。

抑制率/%=[1-(ODA-ODB)/(ODC-ODD)]×100%。

式中，ODA为表中反应液A在450 nm处的吸光值;ODB为表中反应液B在450 nm处的吸光值;ODC为表中反应液C在450 nm处的吸光值;ODD为表中反应液D在450 nm处的吸光值。

表2 反应液的组成

1.4 数据分析

所有试验处理均设置3次重复, 利用SPSS 22.0和Graphpad Prism 7程序对结果进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 紫松果菊不定根提取物浓度对酪氨酸酶活性抑制的影响

由试验结果可知,紫松果菊不定根中提取物浓度在一定区间内随着浓度的增加,其酪氨酸酶活性的抑制率逐步升高(表3),当其浓度达到0.8 mg/mL时,酪氨酸酶活性的抑制率达到了最高,IC50为0.7 mg/mL。

表3 紫松果菊不定根提取物浓度对酪氨酸酶活性抑制的影响

2.2 紫松果菊不定根料液比对酪氨酸酶活性抑制的影响

在不定根的提取过程中,料液比对酪氨酸酶活性的抑制作用较为明显(图1),紫松果菊不定根料液比为1∶10～1∶40时,对酪氨酸酶活性的抑制率呈增大趋势,当料液比达到1∶40时，抑制率最大,之后开始下降。因此,最佳料液比为1∶40。

图1 紫松果菊不定根料液比对酪氨酸酶活性抑制的影响

2.3 紫松果菊不定根提取次数对酪氨酸酶活性抑制的影响

紫松果菊不定根在提取2次以内时,随着提取次数的增加酪氨酸酶活性的抑制率逐渐升高;提取次数在2次时，抑制率最高(52%);提取次数达到2次以上,酪氨酸酶活性的抑制率呈下降趋势(图2)。因此，最佳提取次数为2次。

图2 紫松果菊不定根提取次数对酪氨酸酶活性抑制的影响

2.4 紫松果菊不定根提取温度对酪氨酸酶活性抑制的影响

紫松果菊不定根提取温度对酪氨酸酶活性抑制的影响较大,提取温度为50 ℃,其成分对酪氨酸酶的活性抑制作用最大(55%);提取温度高于50 ℃时,酪氨酸酶活性的抑制率逐渐降低(图3)。说明温度过低或过高都不利于提取紫松果菊不定根中有效成分以及提升酪氨酸酶活性的抑制作用,因此，最佳提取温度为50 ℃。

图3 紫松果菊不定根提取温度对酪氨酸酶活性抑制的影响

2.5 紫松果菊不定根提取时间对酪氨酸酶活性抑制的影响

提取时间为0.5～1.5 h时,紫松果菊的不定根提取物使酪氨酸酶活性的抑制率逐渐升高;提取时间为1.5～2.0 h时,酪氨酸酶活性抑制率降低(图4)。这可能是随着提取时间的增加,紫松果菊中抑制酪氨酸酶活性的有效物质逐渐溶解,但提取时间过长,有些物质会被破坏,使得抑制率降低,所以最佳提取时间确定为1.5 h。

2.6 正交试验

依据单因素试验所得结果,设计4因素3水平L9(34)正交试验方案,对料液比(A)、提取次数(B)、提取温度(C)、提取时间(D)4个因素进行组合,探究不同组合对酪氨酸酶活性抑制的影响,正交试验方案及结果见表5。

图4 紫松果菊不定根提取时间对酪氨酸酶活性抑制的影响

表5 正交试验方案及结果

表5中的第4组,即提取条件为料液比1∶50、提取2次、提取温度30 ℃、提取时间1.5 h时,对酪氨酸酶活性的抑制率最高,达到64%,高于其他组合。对极值R进行分析的结果显示,R值由大到小的顺序分别为提取时间(D)>提取次数(B)>料液比(A)>提取温度(C),表明不同提取条件对酪氨酸酶活性抑制的影响不同。分别计算各因素水平对酪氨酸酶活性抑制的平均值K,发现料液比(A)、提取次数(B)中K3值最大,提取温度(C)中K1值最大,提取时间(D)中K2最大,此时的提取条件为A3B3C1D2,即：料液比1∶50、提取3次、提取温度30 ℃、提取时间1.5 h。

对正交试验中所得提取工艺(A3B3C1D2)进行验证试验,并与第4组提取条件(A3B2C1D2)的试验结果进行对比,发现紫松果菊不定根在A3B3C1D2提取条件下对酪氨酸酶活性的抑制率均值为62%,低于第4组试验结果,因此,本试验最佳提取工艺为A3B2C1D2(表6)。

表6 验证试验结果

2.7 紫松果菊不定根提取物中主要活性成分含量的测定

研究发现紫松果菊不定根提取物中含有多种活性成分,如酚类、黄酮类及多糖等,它们均具有美白效果,由于它们与酪氨酸酶的底物结构相似,能作为底物类似物结合酪氨酸酶,从而起到抑制黑色素生成的作用[24]。本试验用筛选出的最佳提取条件进行紫松果菊不定根提取,对提取物中总酚、黄酮、多糖3种主要活性成分的含量进行了测定,发现提取物中总酚含量为78.4 mg/g、黄酮含量为70.6 mg/g，多糖含量为196.3 mg/g(表4),其中，多糖含量最高。

表7 紫松果菊不定根提取物中3种活性成分的含量

3 讨论

紫松果菊富含松果菊苷及多糖、多酚等多种生物活性物质，药用价值极高，对酪氨酸酶的抑制作用显著，具有潜在的美白价值，可用于化妆品、保健品及医药行业。目前, 市面上大多数化妆品尽管具有美白与护肤的功效, 但其主要成分为化学物质, 副作用较大。此外, 很多产品中含有化学合成的酪氨酸酶抑制剂，如熊果苷、曲酸等[25],但这些化学合成物质的毒副作用及安全性已受到人们的广泛关注。

植物中有效成分的提取方法能直接影响到对酪氨酸酶活性抑制的影响,筛选出最佳提取工艺极为重要。蒋晓龙等[26]研究了东北刺人参不定根不同提取条件对酪氨酸酶活性抑制的影响,结果表明当提取时间为1.5 h时,东北刺人参提取物对酪氨酸酶活性抑制率达到最高,这与本试验所得结果相似。石浩[27]在对不同枣品种多糖含量分析的研究基础上,进行了多糖的提取、分离纯化及活性测定研究,筛选出的最佳提取工艺中料液比为1∶40(g∶mL),此条件下的多糖提取物对酪氨酸酶活性影响较大,这与该试验结果相似。金宏飞等[28]以酪氨酸酶活性抑制率为考察目标,对提取因素进行正交试验的结果表明,当提取次数为2次时,川芎提取物对酪氨酸酶活性的抑制率达到最高,与该试验结果相似。

4 结论

试验结果表明,紫松果菊不定根提取物浓度达到0.8 mg/mL时,酪氨酸酶活性的抑制率达到最高(53.9%),IC50为0.7 mg/mL;筛选出的紫松果菊不定根对酪氨酸酶活性抑制影响的最佳提取工艺为：料液比1∶50(g∶mL)，提取2次，提取温度30 ℃、提取时间1.5 h,此时不定根提取物使酪氨酸抑制率达到64%;该条件下的不定根提取物中总酚、黄酮、多糖3种活性成分的含量分别为78.4 mg/g、70.6 mg/g和196.3 mg/g,多糖含量最高。