摘 要 目的：建立一种操作简便，并能高效获得高质量的具有新霉素抗性（neo）的C57BL/6J小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast cells， MEF细胞）的分离培养方法;所得细胞经过丝裂霉素C处理后能作为饲养层细胞支持小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells， mESC）的生长和neo抗性筛选。方法：取12.5-14.5d的胎鼠躯干部剪碎成糊状，利用Collagenase type IV和Trypsin的消化作用获得原代MEF细胞。使用丝裂霉素C处理MEF细胞获得饲养层细胞。结果：制备得到的MEF细胞形态饱满、增殖速度快、细胞数量充足。使用丝裂霉素C处理细胞后，细胞正常存活但失去增殖能力，能支持mESC的生长和neo抗性筛选。结论：成功制备具有neo抗性的MEF细胞和饲养层细胞。

关键词 新霉素 MEF细胞 mESC 丝裂霉素C 饲养层

中图分类号：R329.2文献标识码：A

1材料与方法

1.1材料

眼用手术剪和镊子各3把、15mL离心管（Nest）、35mm细胞培养皿（Nest）、冻存管（Thermo）、梯度降温盒（Thermo）、台式高速冷冻离心机（Thermo）、显微镜（Olympus）。

1.2试剂及溶液配制

DMEM/F12培养基、0.25% Trypsin-EDTA、100譍lutaMAX Supplement、100譓EM Non-Essential Amino Acids Solution（NEAA）、FBS 、PBS、100姿埂？.22%em过滤器均购自Thermo Fisher Scientific;Collagenase type IV、丝裂霉素C、DMSO购自Sigma公司。

1.3溶液配制

（1）胶原酶消化液：根据该批次Collagenase type IV的酶活单位，取适量用DMEM/F12培养基溶解，配制成2000uint/mL，即10證ollagenase type IV，使用0.22%em过滤器除菌后备用。先吸取2.7mL的 DMEM/F12放置到15mL的离心管内，再加入300%eL 10證ollagenase type IV，混合均匀，即为胶原酶消化液。

（2）完全培养基：15% FBS+1譍lutaMAX Supplement+1譔EAA+1姿？82% DMEM/F12。

1.4实验动物

SPF级的C57BL/6J-Tg（pPGKneobpA）/Nju小鼠购自南京大学模式动物中心，饲养于苏州大学实验动物中心SPF屏障系统。動物实验操作严格遵守苏州大学实验动物伦理委员会的要求。

2方法

2.1原代MEF细胞制备

（1）12-16周龄的C57BL/6J-Tg（pPGKneobpA）/Nju雌雄小鼠按照2：1比例合笼配种，第二天早上观察有无阴道栓以确定是否配种，如有则记为孕0.5d。

（2）孕12.5至14.5d时，颈椎脱臼法处死孕鼠，鼠体放于75%乙醇溶液中浸泡1min减灭体表细菌。

（3）剪除孕鼠腹部的毛发，然后剪开腹部皮肤及肌肉层，暴露子宫。更换一套手术器械，用镊子提起子宫颈端并剪断，分离子宫系膜并剪断子宫角，取出整个子宫置于培养皿中，用PBS洗除子宫上的体液。

（4）更换手术器械，在超净工作台内剪开子宫，取出胎鼠，在含10姿沟腜BS中洗涤数次。去除胎鼠的头尾、四肢及内脏团，仅保留躯干部，并用PBS漂洗去除躯干部的红细胞及胎肝等。

（5）将躯干部转移至35mm细胞培养皿中，将躯干部剪成小于1mm3的组织块。然后加入3mL的胶原酶消化液，反复吹打混匀后，置于37℃，5%CO2饱和湿度细胞培养箱内消化过夜。

（6）将上步消化后得到的细胞悬液吹打均匀，收集到15mL的离心管中，1000rpm/min离心5min，弃上清。向离心管中加入500%eL的Trypsin，37℃消化20min，然后加入1mL的完全培养液终止消化，并用枪头吹打均匀。1000rpm/min离心5min，弃上清，加入5mL完全培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至35mm细胞培养皿中，置于细胞培养箱中培养。

2.2饲养层细胞制备

MEF细胞在培养皿中生长达到80-90%饱和度时，去除旧培养基，PBS洗涤1次，加入含有10%eg/mL的丝裂霉素C的完全培养基，置于细胞培养箱中处理3小时。3小时后去除旧培养基，PBS洗1次，终止丝裂霉素C的处理。此时细胞即可作为mESC的饲养层使用。

3结果

光学显微镜下观察，MEF细胞多呈梭形，形态饱满，胞质透明（A图）。使用丝裂霉素C处理MEF细胞后，向该培养皿中接种消化后的mESC，培养2-3天，培养过程中观察到mESC克隆逐渐增大，克隆边缘紧致、清晰，生长状态良好，mESC仍保持未分化状态（B图）。

4讨论

随着生物医学研究的日益发展，基因敲除小鼠作为最常用的动物模型在科学研究中起到重要作用。而目前，条件性基因敲除小鼠模型的制作还主要基于ES细胞打靶技术，此方法需要大量的MEF细胞作为饲养层来支持、稳定mESC的生长和neo抗性筛选。因此，制备具有neo抗性的MEF细胞具有十分重要的作用。MEF细胞不仅可以作为mESC的饲养层，近年来又广泛用于皮肤组织损伤修复研究;核移植和重编程研究;辐射损伤后的细胞迁移及凋亡研究等。

本研究使用C57BL/6J-Tg（pPGKneobpA）/Nju胎鼠作为MEF细胞的取材对象，以组织块消化法建立了一种简便经济的成纤维细胞的分离培养方法。与传统的组织块培养法相比较，该方法具有成纤维细胞获得数量多、生长状态好、非实质性细胞污染少及细胞污染风险低等优点。

參考文献

[1] Thomas，K.R.&C.Deng&M.R.Capecchi.High-fidelity gene targeting in embryonic stem cells by using sequence replacement vectors[J]. Molecular & Cellular Biology，1992（12）： 23-2919.

[2] Park，Y.G.&S.E.Lee&E.Y.Kim，et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro[J].Dev. Reprod， 2015，19（03）： 119-126.

[3] Zhou，Y.&H.Mao&B.Joddar，et al. The significance of membrane fluidity of feeder cell-derived substrates for maintenance of iPS cell stemness[J]. Sci Rep， 2015，12（05）： 11386.

[4] Li，W.&A.Mukherjee&J.H.Wu，et al. Sperm Associated Antigen 6（SPAG6） Regulates Fibroblast Cell Growth， Morphology，Migration and Ciligenesis[J]. Sci Rep， 2015（05）： 16506.

[5] Mansoori-Moghadam，Z.&M.Totonchi&M.Hesaraki，et al. Programming of ES cells and  reprogramming of fibroblasts into renal lineage-like cells[J].Exp Cell Res，2019（379）： 225-234.

[6] Antunovic，M&I.Matic&B.Nagy，et al. FADD-deficient mouse embryonic fibroblasts undergo RIPK1-dependent apoptosis and autophagy after NB-UVB irradiation[J].J Photochem Photobiol B，2019（194）： 32-45.