付红艳，王义勇，张科东，周凤

肺癌已成为多数国家恶性肿瘤死亡的首要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的一种常见类型［1］，发病隐匿，多数患者诊疗时已属于晚期，无手术治疗指征［2］。因此寻找非小细胞肺癌相关的分子标志，以便预测肿瘤进展情况，进而早期诊断、早期治疗对于改善患者预后尤为重要［3］。黏蛋白1（MUC1）是一种主要分布于器官上皮细胞近管腔或腺腔面的跨膜糖蛋白，可介导信号转导和细胞黏附［4］。研究发现，乳腺癌组织中MUC1的表达与乳腺癌的分化程度及临床分期存在相关性［5］。但是关于MUC1表达在NSCLC中的研究较少。本研究采用酶联免疫吸附法及免疫组织化学染色法检测NSCLC患者血清及癌组织中MUC1蛋白的表达，分析其表达水平与NSCLC临床特征的关系，进一步明确其在NSCLC患者临床早期诊断及治疗中的预测价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年12月—2018年12月宁夏医科大学总医院普胸外科和呼吸与危重症医学科收治的119例患者为研究对象。根据病理类型分为肺鳞癌组34例，其中男29例，女5例，高分化5例，低中分化29例，Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期16例；肺腺癌组65例，其中男38例，女27例，高分化15例，低中分化50例，Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期30例；非肺癌组20例，其中男10例，女10例，肺炎性假瘤5例，肺良性结节4例，肺结核3例，肺硬化性血管瘤2例，干燥综合征2例，良性肿瘤4例，此类患者均高度怀疑肺部恶性肿瘤，经术中病理检查排除。所有患者入院后空腹采集外周静脉血后分离血清，手术时或支气管镜检查时切除肺癌组织和正常肺组织，-80℃冰箱保存备用。病理分化程度按照WHO病理分化标准，临床分期按照国际第八版肺癌TNM分期标准。

1.2纳入及排除标准 所有纳入患者均经病理学检查确诊为NSCLC和肺部良性病变，排除存在气道炎症的肺部疾病如肺炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病等，排除心、肝、肾等器官功能衰竭患者，排除既往其他类型肿瘤病史患者。所有研究对象均对本研究知情并签署知情同意书，研究方案获得医院伦理道德委员会批准（伦理编号：2018-288）。

1.3主要试剂 MUC1兔抗人单克隆抗体购自美国Affinity公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗购自美国Abbkine公司；人MUC1酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒购自上海宝曼生物科技有限公司，酶标仪（型号ELx800）购自BIO-TEK公司，电子显微镜购自日本Olympus公司，低温离心机购自德国Sigma公司。

1.4方法

1.4.1ELISA检测各组血清MUC1蛋白水平 将收集到的血清标本严格按照试剂盒说明书操作。将标准品孔各加入不同浓度的标准品50µL，样本孔加入待测样本血清10µL，再加血清稀释液40µL；标准孔及样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的MUC1抗体100µL，封闭后37℃恒温箱温育60 min后洗涤5次。每孔继续加入底物A、B各50µL，37℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50µL，10 min后，用酶标仪测定各孔在450 nm波长下的光密度（OD）值。

1.4.2HE染色 将收集的肺组织标本经二甲苯固定、石蜡包埋，并进行连续切片，厚度为3µm，切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脱蜡10 min后，依次放入100%、95%、85%、70%乙醇各5 min，经蒸馏水冲洗后转入苏木素染液染色1～2 min，用分化液分化数秒后流水冲洗2 s，返蓝液返蓝数秒至细胞核呈蓝色后流水冲洗10 min，继而入伊红染色液10 min，再次流水冲洗后，依次放入70%、85%、95%、100%乙醇各5 min脱水后经二甲苯透明2次，每次约5 min，最后经中性树胶封固，光学显微镜下观察拍照。

1.4.3免疫组织化学染色 将肺组织切片经二甲苯脱蜡、浓度梯度乙醇至蒸馏水水化，再经3%甲醇双氧水室温孵育20 min消除内源性酶，高压修复之后放入PBS洗3次，每次5 min，滴加MUC1兔抗人一抗（1∶50），次日再次放入PBS洗3次，每次5 min，切片上滴加二抗辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗，37℃避光20 min后，放入PBS洗3次，每次5 min，滴加DAB染液显色5～10 s，水洗终止显色，最后经苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、封片、显微镜下随机读取5个高倍视野对阳性细胞比例和染色强度进行半定量测定。染色强度评分标准：0分（未着色），1分（橘黄色），2分（棕黄色），3分（黄褐色）。阳性细胞所占比例评分标准：0分（＜5%），1分（5%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（＞75%）。2种评分相加总分＜2分为阴性，≥2分为阳性。

1.5统计学方法 运用SPSS 19.0软件对采集数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，计数资料均以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。受试者工作特征（ROC）曲线用于分析血清MUC1蛋白对不同类型NSCLC诊断价值，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.13组患者血清MUC1蛋白表达水平比较 肺鳞癌组、肺腺癌组、非肺癌组血清中MUC1蛋白的表达水平分别为（35.70±9.17）U/mL、（37.08±10.24）U/mL、（26.83±2.93）U/mL，组间比较差异有统计学意义（F=9.775，均P＜0.05）；肺鳞癌组、肺腺癌组血清MUC1蛋白表达水平均高于非肺癌组，而肺鳞癌组、肺腺癌组血清MUC1蛋白表达水平差异无统计学意义。

2.2血清MUC1蛋白对不同类型NSCLC的诊断效能分析 ROC曲线分析结果显示，血清MUC1蛋白诊断肺鳞癌的ROC曲线下面积（AUC）为0.774（95%CI：0.651～0.896），以MUC1蛋白＞33.23 U/mL为阳性临界值，其诊断敏感度为52.94%，特异度为100%，见图1A。血清MUC1蛋白诊断肺腺癌的AUC为0.785（95%CI：0.690～0.880），以MUC1蛋白＞31.31 U/mL为临界值，其诊断敏感度为61.54%，特异度为95%，见图1B。

Fig.1 ROC curve of serum MUC1 protein in diagnosis of different types of NSCLC图1 血清MUC1蛋白诊断不同类型NSCLC的ROC曲线

2.3不同类型NSCLC癌组织病理表现 HE染色结果显示，肺鳞癌细胞多呈巢状分布，中央分布环状红染的角化物，见图2A；肺腺癌细胞多呈小条索状排列，形成腺管样结构，见图2B。

Fig.2 Different types of NSCLC cancer tissue under HE staining(×200)图2 不同类型NSCLC癌组织经HE染色（×200）

2.4MUC1蛋白在不同类型NSCLC组织中的表达情况 MUC1蛋白主要在胞质及胞膜中表达，阳性颗粒呈棕黄色或黄褐色分布，见图3。肺鳞癌组癌组织中MUC1蛋白阳性率为64.71%（22/34），肺腺癌组癌组织中MUC1蛋白阳性率为73.85%（48/65），非肺癌组肺组织中MUC1蛋白阳性率为5%（1/20），肺鳞癌及肺腺癌组癌组织中MUC1蛋白的阳性表达率均高于非肺癌组，差异有统计学意义（χ2分别为18.36、29.69，均P＜0.017），而肺鳞癌组、肺腺癌组癌组织中MUC1蛋白表达水平比较差异无统计学意义（χ2=0.90，P＞0.05）。

Fig.3 Expression of MUC1 protein in different types of NSCLC cancer tissues(×400)图3 MUC1蛋白在不同类型NSCLC癌组织中的表达（×400）

2.5MUC1蛋白表达与不同类型NSCLC临床特征的关系 肺鳞癌组中不同性别、年龄、分化程度、TNM分期分组患者血清及癌组织MUC1蛋白阳性表达率比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。肺腺癌组中-低组织分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期组患者血清及癌组织的MUC1蛋白阳性表达率分别高于高组织分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期组（P＜0.05）；而不同性别、年龄分组患者血清及癌组织MUC1蛋白阳性表达率差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

Tab.1 The relationship between the expression of MUC1 protein and the clinical characteristics of lung squamous cell carcinoma表1 MUC1蛋白表达与肺鳞癌临床特征的关系 例（%）

3 讨论

我国每年新增约65.3万例肺癌患者，其中NSCLC患者占到了80%以上［6］。自靶向药物出现以来，NSCLC的治疗取得了一定的进展［7］，但由于临床中早期预测、诊断NSCLC的手段有限，导致NSCLC患者远期生存改善并不明显。MUC1是分布于机体各种上皮表面的高度糖基化的糖蛋白，可介导信号转导和细胞黏附功能等［8］。Ma等［9］研究发现，MUC1的高表达与唾液腺腺泡细胞癌组织学类型、病变部位、颈淋巴结转移、局部复发和远处转移有关，提示与唾液腺腺泡细胞癌的发生发展有关。Jing等［5］研究发现，MUC1的过度表达与乳腺癌患者预后不良相关，并与MUC1启动子甲基化状态有关，提示可能是乳腺癌的潜在预后因素和治疗靶点。Li等［10］研究发现MUC1高表达与结直肠癌坏死、分期、浸润深度和淋巴结转移相关，可预测结直肠癌预后不良和生存结局。这些研究表明MUC1在腺上皮来源的肿瘤中存在高表达，且与不同腺上皮来源肿瘤的预后存在相关性，提示MUC1在NSCLC中可能存在高表达，且与其恶性程度及不良预后可能存在一定相关性。本研究中，ELISA和免疫组化染色结果显示肺腺癌组患者血清及癌组织中MUC1蛋白的表达水平均高于非肺癌组。肺腺癌组内中-低组织分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期组患者血清及癌组织MUC1蛋白阳性表达率高于高组织分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期组，提示MUC1蛋白在腺上皮来源的肺腺癌进展中起到一定作用，高水平的MUC1蛋白表达可能提示肺腺癌恶性程度及预后不良，与上述研究结果基本一致。肺鳞癌组患者血清及癌组织中MUC1蛋白的表达水平同样高于非肺癌组，但肺鳞癌组患者血清及癌组织的MUC1蛋白阳性表达率与不同分化程度、TNM分期无明显关系，提示MUC1蛋白在鳞状上皮来源的肺鳞癌中也存在一定的表达，但无法预测肺鳞癌恶性程度及预后不良。

Tab.2 The relationship between expression of MUC1 protein and clinical characteristics of lung adenocarcinoma表2 MUC1蛋白表达与肺腺癌临床特征的关系 例（%）

本研究中采用ROC曲线分析血清MUC1蛋白对不同类型NSCLC诊断价值，发现MUC1蛋白诊断肺鳞癌、肺腺癌具有中等诊断效率（AUC分别为0.774、0.785），提示血清中MUC1蛋白表达水平的高低可能成为NSCLC的非侵入性生物标志物，可用于NSCLC早期检测，但MUC1蛋白诊断肺鳞癌的敏感度低于60%，而其诊断肺腺癌敏感度大于60%，可能原因为MUC1蛋白在腺上皮来源的肿瘤中存在更高表达，而肺鳞癌为鳞状上皮来源的肿瘤，同时与检测样本中鳞癌数目较少可能也有一定关系。

综上所述，NSCLC患者血清及癌组织中MUC1蛋白呈高表达，高水平的MUC1蛋白表达提示肺腺癌恶性程度及预后不良，可用于预测肺腺癌早期临床诊断，但对肺鳞癌恶性程度及预后不良预测意义有限。本研究的局限性在于只检测了MUC1蛋白在NSCLC血清及癌组织中表达异常，不足以完全解释MUC1与NSCLC发生发展及侵犯、转移的相关性，有待于今后在细胞、基因水平进行更深层次的研究。