余艳玲 彭昊 冯世文

摘要：针对罗非鱼无乳链球菌Sip基因建立了LAMP检测方法，并对野外样本进行了无乳链球菌的调查研究。结果表明，目标Sip基因可在63 ℃ 40 min内被LAMP检测到，比PCR快约2 h，其DNA检测最低浓度为3.55×10-5 ng/μL，灵敏度比PCR高100倍，且对参考细菌无扩增。野外样品检测结果表明，运用LAMP检测技术对GBS的检出率为81.3%，比PCR高约20.0%。应用LAMP和PCR分别检测健康罗非鱼GBS检出率4.4%和2.2%，检测池塘水样品GBS检出率分别为10.0%和6.7%。

关键词：罗非鱼;无乳链球菌（GBS）;环介导等温扩增（LAMP）

中图分类号：S917   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）13-0200-04

链球菌病已成为全球罗非鱼最严重的疾病之一[1]，每年造成的经济损失达4 000多万美元[2-3]。过去数十年，我国罗非鱼链球病逐年增长，其优势种类已经从海豚链球菌（Streptococcus iniae）转变为无乳链球菌（S. agalactiae，也称B族链球菌或GBS）。过去5年，由链球菌导致的罗非鱼死亡率达15%～95%[2]。GBS不仅会引起水生或半水生生物[4-5]，包括野生鱼类[6-7]和养殖鱼类[8-9]严重的疾病，也可导致新生儿严重的脑膜炎[10]和成人败血症[11-12]。人类或牲畜的GBS对罗非鱼具有潜在的感染性[13]，而来自罗非鱼的GBS也可能导致人类感染[14]。因此，罗非鱼和/或水环境中GBS菌株的存在增加了公共卫生安全的风险，这就需要研发采取一种快速、灵敏和可靠的污染链球菌检测方法，通过采取适当的防控措施，保护易感染群体免受这种人畜共患病原体的侵袭。

环介导等温扩增技术（LAMP）是一种敏感、快速和低成本的检测方法，在等温条件下扩增靶基因核苷酸，通常在 1 h 内完成[15-16]，扩增产物可通过浊度或荧光染料监测。此外，LAMP检测可在野外进行，因此可用于现场测定[16]。基于LAMP的优点，本研究开发了一种针对GBS Sip基因可用于野外现场检测的单步LAMP法，并对其特异性和灵敏性进行评价。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 细菌菌株 罗非鱼GBS菌株、大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）、哈氏弧菌（Briohatveyi）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）与海豚链球菌（S. iniae），均由广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室鉴定和保存。

1.1.2 主要试剂 细菌全基因组DNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;Loopamp DNA扩增试剂盒购自日本荣研生物科技公司;PCR Master Mix、DNA Marker、钙黄绿素等，购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 待检样品 2014年7—9月，从野外共收集样品490份，其中健康罗非鱼样品45份，患病罗非鱼样品415份及养殖罗非鱼的池塘水样品30份（表1）。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的制备 将GBS接种到胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中，28 ℃下培养18 h，12 000 r/min离心10 min，沉淀重悬于200 μL PBS中，采用基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA。取10 mg罗非鱼脑组织于0.9 mL PBS中清洗，无菌研钵研磨，采用基因组DNA提取试剂盒提取DNA。池塘水经离心沉淀后提取DNA。

1.2.2 引物设计与合成 根据GBS Sip基因序列（GenBank：HQ878436.1、DQ914255.1-DQ914274.1），采用Primer Explorer version 4（http：/primerexplorer.jp/lamp）设计GBS的LAMP引物。外部正向引物（F3）引物和反向引物（B3）序列分别为F3：5′-GTAGCAGCCCCTAGAGTG-3′，B3：5′-GTTGTGCTACCGGTGTTG-3′;内部正向引物（FIP）和反向引物（BIP）序列分别为FIP：5′-AGCTGATACATGCTCTGGTGATGGCAAGTGTTAAAGTAGTCACTC-3′，BIP：5′-GTTCCTGTGACTACGACTTCAACTTTTGTGCTACCGGAAGG-3′。NCBI BLAST程序检查引物序列的特异性。引物F3和B3用于PCR扩增，以对比LAMP的灵敏性和特异性。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 LAMP反应检测 采用Loopamp DNA扩增试剂盒进行LAMP反应，反应体系为25 μL，其中FIP和BIP各 40 pmol，F3和B3各5 pmol，2×Reaction Mix 12.5 μL，钙黄绿素25 μmol/L，Bst DNA聚合酶1 μL，以及3.55×101 ng/μL基因组DNA 2 μL。LAMP反应在LA-320C实时浊度计中进行，在63 ℃测定60 min，然后在80 ℃灭活5 min。以蒸馏水代替DNA模板作为阴性对照。

1.2.4 PCR擴增检测 采用F3和B3为扩增引物进行GBS的PCR检测，扩增长度为196 bp。PCR反应总体积为25 μL，包括PCR Master Mix 12.5 μL，引物F3和B3各1 μmol/L、3.55×101 ng/μL基因组DNA 2 μL。反应条件为：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30次循环;72 ℃最终延伸10 min。采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，溴化乙锭染色，Bio-Rad Gel Doc EQ凝胶成像系统成像分析。

1.2.5 LAMP檢测的特异性 以GBS菌株作为阳性对照，以蒸馏水作为阴性对照，以大肠杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、爱德华氏菌、哈氏弧菌、创伤弧菌和与海豚链球菌作为参考细菌，进行LAMP的特异性检测。

1.2.6 LAMP和PCR检测灵敏度比较 将罗非鱼GBS DNA连续10倍稀释，稀释后的浓度范围为3.55×101～3.55×10-7 ng/μL。应用LAMP和PCR方法分别对其进行检测，比较2种检测技术对GBS DNA的最低检测浓度。同时，采用直接目视检测法，LAMP反应在水浴中进行，当LAMP反应终止约1 h后，加入钙黄绿素染料进行终止反应，利用紫外光照射观察反应结果。

1.2.7 野外样本的检测 采用LAMP和PCR检测技术，分别对收集的490个野外样本进行了GBS检测。

2 结果

2.1 LAMP检测的特异性

以GBS为阳性菌株，蒸馏水为阴性对照，8株罗非鱼养殖池塘中常见的细菌为参考菌株，对LAMP引物进行特异性检测，结果发现，仅GBS能检测到扩增产物，其他8种参考细菌及阴性对照均无扩增产物（图1），表明该引物组可用于无乳链球菌Sip基因的扩增，因此将引物FIP和BIP用作LAMP反应的引物。

2.2 LAMP检测的灵敏度

由图2可知，LAMP和PCR对罗非鱼GBS DNA的最低检测浓度分别为3.55×10-5ng/μL和3.55×10-3 ng/μL，即LAMP检测灵敏度为PCR的100倍。罗非鱼GBS DNA浓度在3.55×101～3.55×10-5 ng/μL间的7个浓度，LAMP反应孵育期分别为33、35、37、41、42、45、53 min（图2A），可检测GBS存在的最早时间点小于 40 min。通过直接目视检测法研究发现，LAMP检测GBS DNA的最低检测浓度也为3.55×10-5 ng/μL。

2.3 野外样本的检测和测序

采用LAMP和PCR检测技术，分别对收集的490个野外样本进行了GBS检测，结果发现，患病罗非鱼样品中，LAMP检测技术对GBS的检出率为81.3%，而PCR对GBS的检出率为60.72%，LAMP方法对GBS的检测比PCR更敏感。同时，健康罗非鱼样本中也检测到GBS，LAMP和PCR技术的检出率分别为4.4%和2.2%，其检测差异较小。利用LAMP和PCR检测技术分别对罗非鱼养殖池塘水样品进行检测，结果显示，池塘水的GBS检出率分别为10.0%、6.7%（表2）。对20个LAMP检测阳性样品进行了测序，经序列比对发现，样品序列与GBS Sip基因部分序列的相似性为100%。

3 讨论

目前，已建立了核糖体基因分型、随机扩增多态性DNA（RAPD）[17-18]和脉冲场凝胶电泳（PFGE）等多种GBS检测方法[19]，然而仅通过表型检测GBS可能会有误导性。一些实验室将CAMP（Christie-Atkins-Munch-Peterson）作为检测GBS的一种方法，但CAMP需要连续2 d过夜培养，非常耗时。PCR或实时荧光定量PCR也被用于GBS检测[20-21]，同时PCR方法需要昂贵的专业仪器设备和试剂消耗，不适用于野外检测，而且本研究建立的LAMP方法较PCR方法敏感性提高100倍，更适用于GBS的检测。尽管有关罗非鱼GBS的LAMP检测方法也有相关报道[22]，但本研究针对鱼类和哺乳动物GBS中高度保守Sip基因序列开发LAMP检测方法，与前人建立的比色LAMP测定方法相比，更能进行实时LAMP测定，不需要打开反应管即可获得检测结果，降低了阳性产物污染实验室的风险。

本研究分别采用LAMP和PCR法检测了罗非鱼和池塘水中的GBS，发现LAMP检测灵敏度高于PCR，同样的样品，LAMP对罗非鱼GBS的检出率为81.3%，而PCR仅为 60.7%，提示LAMP法更适用于实地检测GBS，也意味着先前采用PCR检测罗非鱼GBS可能低估了GBS的传播范围或GBS引起的死亡率。另一方面，本研究中罗非鱼GBS的平均检出率为81.3%，低于Chen等报道GBS的平均检出率（97.7%）[2]，这可能是由于2项研究所收集样品的时间段不同造成的。Chen等收集样品的时间段为2009—2011年[2]，是我国罗非鱼链球菌发病的高峰期，而本研究样品收集时间为2014年，与其相比，罗非鱼链球菌病的发病率较低，故检出率较低，此外还可能是2项研究中样本量的差异导致的。

Li等研究发现，无典型临床症状或死亡的罗非鱼或为GBS的载体[23]。本研究的野外样品检测结果显示，应用LAMP和PCR在健康无症状的罗非鱼大脑样品检测到GBS，与Li等研究的结果[23]一致，表明罗非鱼可能为GBS病原体的无症状携带者。此外，采用LAMP和PCR分别从池塘水中检测到GBS，表明GBS可能在野生环境中正常生长，当罗非鱼的免疫反应较弱时才可能感染。虽然目前尚无罗非鱼源GBS菌株对人类感染性的研究报道，但应高度关注野生环境中GBS能在罗非鱼与人类之间传播，并采取一些切实可行的措施以防止该病发生。

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