翟雪 张栩 连光倩

摘要：稻穗大小是决定水稻产量的重要性状，为了挖掘与穗型相关的基因，为水稻产量遗传育种研究提供理论基础和应用价值，以大穗籼稻地方品种宝大粒（BDL）和小穗粳稻品种矮格拉（AGL）为亲本，构建F2代群体，对穗型性状进行数量性状座位（QTL）初步分析;根据F2群体定位结果，标记选择区间杂合体，自交构建F4分离群体，验证QTL位点。结果表明，在F2群体中共检测到与5个穗型相关性状的6个QTLs，分别位于第2、6、7染色体上。二次枝梗数QTL qNSB7和一次枝梗数QTL qNPB7定位于第7染色体的RM542～A83区间，LOD值（表示连锁可能性的大小）分别为10.84和5.03，分别解释30.74%和12.34%的表型变异，并且在其相邻的A85～A28和A83～A85区间分别检测到每穗颖花数QTL qSNP7和穗长QTL qPL7，LOD值分别为5.31和4.12，表型贡献率分别为14.80%和11.82%。另外，在第2染色体上检测到1个穗长QTL qPL2，LOD值为3.76，表型贡献率为9.12%;在第6染色体上检测到1个结实率QTL qSSR6，LOD值为4.34，表型贡献率为11.26%。以qNSB7为目标QTL，在F4分离群体中进行验证，结果表明，qNSB7仍位于RM542和A83标记之间，LOD值为9.84，解释了30.74%的表型变异，且其他3个QTLs qSNP7、qPL7和qNPB7都聚集在这317 kb的区间，解释了17.2%～24.6%的表型变异。由结果可知，qNSB7是1个通过增加二次枝梗数，影响每穗颖花数、一次枝梗数和穗长的一因多效新位点。

关键词：水稻;穗型相关性状;QTL定位

中图分类号： S511.03  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）13-0059-05

水稻是最重要的粮食作物，提高水稻产量成为解决未来粮食危机的重要手段，也是水稻育种和生产的主要目标。影响水稻产量的因素很多，而单位面积产量可以被解析为穗数和单穗谷粒质量，后者更具有生产意义。单穗谷粒质量由每穗颖花数、结实率和千粒质量3个因素构成，增加每穗颖花数是最重要的高产育种方向和栽培策略。作为重要的穗部性状，每穗颖花数与一次枝梗数、二次枝梗数、穗长等性状密切相关。这些性状在不同群体和环境中定位的数量性状座位（QTL）结果有较大的差异，被认为是受多基因控制的数量性状，且受遗传背景和环境影响[1]。目前已经定位的有关水稻穗部性状的QTLs有很多，不均匀地分布于水稻基因组中[2-6]。例如，Luo等利用1套以籼稻高产栽培品种桂朝2号为背景的普通野生稻的渐渗系，检测到39个穗部性状的QTLs，包括穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗颖花数和小穗密度[7]。大多数控制穗相关性状的QTLs都集中在同一染色体上，这就解释了这些性状之间的显著相关性。

近年来，一些穗部性状的QTLs被解析为单一遗传因子从而得到图位克隆。Gnla是首个被克隆的水稻穗粒数QTL，Gnla是1个与细胞分裂素氧化酶/脱氢酶高度同源的OsCKX2基因[8]。OsCKX2表达量的降低会引起花序分裂组织中细胞分裂素的积累，从而增加颖花数量，提高产量。DEP1是控制水稻直立穗的基因[9]，突变的DEP1通过促进细胞分裂，使稻穗变密，枝梗数増加，穗粒数增加，而穗颈节长度变短。LAX2[10]/Gnp4[11]编码1个核蛋白，调控水稻腋生分生组织的形成。LAX2能与LAX1蛋白互作，通过调控穗型疏密程度来影响每穗粒数。OsSPL14是调控水稻株型和穗型的基因[12]，OsSPL14突变后，使水稻分蘖数减少，穗粒数、千粒质量增加。LP（EP3）是大穗基因，编码1个富含Kelch的F-box蛋白，集中在枝梗原基区域表达，主要调控穗型[13]。PROG1编码1个由167个氨基酸组成的锌指转录因子，主要在腋芽分裂组织中表达[14]。在水稻的进化过程中，PROG1功能丧失，由匍匐生长变成直立生长，株型得到改良，而且穗粒数增加，产量大幅度提高。SP1编码1个可能的多肽转运蛋白（PTR），是控制枝梗延伸、决定穗长的基因[15-16]，突变体（short panicle1，简称sp1）稻穗变短。

本研究以大穗大粒籼稻地方品种宝大粒（BDL）和小穗粳稻品种矮格拉（AGL）为亲本，通过构建F2群体和F4次级分离群体，在第7染色体的RM542和A83区间定位并确认了1个通过增加二次枝梗数，提高每穗颖花数，同时影响一次枝梗数、穗长的一因多效QTL，为后续进行精细定位、克隆和机制的研究提供重要基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究材料以大穗籼稻品种宝大粒（BDL）、小穗粳稻品种矮格拉（AGL）为亲本，杂交获得F1代，F1代自交获得F2代分离群体（182个单株），用于QTL的初定位。根据F2代结果，标记选择目标QTL区间杂合型F2代，种植鉴定F2 ∶ 3家系（60株）。在目标性状分离、其他农艺性状相对一致的F2 ∶ 3家系中，再次选择区间杂合体，种植F3 ∶ 4次级分离群体，用于验证定位结果。2015年种植F2群体，2016年种植F3群体，2017年种植F4群体，以上群体都种植于南京农业大学江浦试验站，单株栽插，株距16.7 cm，行距20.0 cm，按照田间常规方法进行种植管理。

1.2 性状调查

在完熟期对应DNA取样编号进行取样，每株收取3个较大的稻穗（边行和边株不取样），装入纸袋，于室内调查穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗颖花数和结实率，将3穗平均值作为该植株表型值。取穗颈节至穗顶（不含芒）的距離为穗长（精确至0.1 cm），随后依次调查一次枝梗数、二次枝梗数、每穗颖花数和结实率。穗部性状调查后，将同一单株的种子装回纸袋，晒干，以备后代种植。

1.3 DNA提取和PCR扩增

在移栽定苗后的分蘖盛期，按田间材料、行、株编号，采集各单株的幼嫩叶片，同时采集亲本叶片，用于提取总DNA。DNA的提取采用Dellaporta等提出的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取方法[17]。

PCR反应体系：采用10 μL体系，含有1 μL DNA（20 ng/μL），各0.5 μL正反向引物（10 μmol/L），0.2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1 μL 10×Buffer（含Mg2+），0.1 μL Taq聚合酶（2.5 U/μL），6.7 μL ddH2O。PCR扩增程序：95 ℃ 5 min;95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，32个循环;72 ℃ 10 min;10 ℃保存。PCR产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行檢测，银染显色，读带，用数码相机拍照并记录试验结果。

1.4 简单重复序列（simple sequence repeats，简称SSR）的引物筛选和InDel标记开发

SSR标记和InDel标记是群体遗传作图的标记。SSR标记都是公开的引物（详见Gramene网站）。InDel标记的设计依据日本晴与93-11水稻基因组序列同一座位上插入和缺失碱基的差异，采用Primer 5软件或通过RiceVarMap（http：//ricevarmap.ncpgr.cn/）在网上设计引物，经NCBI（美国国立生物技术信息中心）网站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）验证引物序列在水稻基因组中的唯一性。标记的物理位置参照日本晴基因组序列。SSR引物和InDel引物均由南京擎科生物科技有限公司合成。涉及QTL位点的InDel标记引物序列见表1。

1.5 QTL分析

用SSR引物和InDel引物对亲本宝大粒与矮格拉的多态性进行筛选，选取具有多态性且条带清晰、易于区分的引物作为候选引物，用于后续使用。用NCBI的Primer-BLAST对候选引物进行物理距离查询。然后对候选引物进行表型和标记基因型关联分析，并根据分子标记所显示的基因型，结合群体表型，采用软件QTL IciMapping 3.30的Mapping和Bipping功能进行遗传连锁图谱的构建和QTL定位。采用完备加性区间的方法，以LOD值（表示连锁可能性的大小）>3.0作为QTL存在的阈值，运算1 000次。

2 结果与分析

2.1 穗型性状表型的鉴定

亲本宝大粒（BDL）和矮格拉（AGL）的穗型差异极大（图1-A、图1-B）。宝大粒是一个大穗型品种，其穗长为（29.3±3.7） cm，一次枝梗数为（15.3±0.9）个，二次枝梗数多达（40.3±3.7）个，每穗颖花数为（230.4±9.6）粒，结实率为（78.0±2.0）%。相反，矮格拉是一个小穗型品种，其穗长仅为（14.2±1.2） cm，一次枝梗数为（5.8±0.8）个，二次枝梗数为（4.7±1.0）个，每穗颖花数为（40.2±3.7）粒，结实率为（91.1±1.0）%。由图1-C、表2可以看出，F2群体的穗部性状中，穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗颖花数和结实率在F2群体的变异幅度分别为13.7～39.1 cm，0.7～18.7个，1.7～51.0个，36.2～270.7粒，2.70%～98.46%，说明这5个性状在F2群体中分离明显，但均呈正态连续分布（图2），符合典型的数量性状特征。

2.2 穗型相关性状的QTL分析

利用1 300对SSR引物和InDel引物在亲本宝大粒与矮格拉之间筛选多态性标记，筛选出共显性标记150个，多态率仅为11.5%。从中挑选出均匀覆盖水稻全基因组的90个标记，用于鉴定F2群体（182株）的基因型，构建连锁图，分析穗型相关的5个性状的QTLs。

QTL分析结果显示，共检测到穗长（PL）、一次枝梗数（NPB）、二次枝梗数（NSB）、穗粒数（SNP）和结实率（SSR）5个穗型性状的6个QTLs（表3）。二次枝梗数QTL qNSB7和一次枝梗数QTL qNPB7定位于第7染色体的RM542～A83区间，LOD值分别为10.84和5.03，表型贡献率分别为30.74%和12.34%，并且在其相邻的A85～A28和A83～A85区间分别检测到每穗颍花粒数QTL qSNP7和穗长QTL qPL7，LOD值分别为5.31和4.12，表型贡献率分别为14.80%和11.82%。即在RM542和A28之间约1 Mb的物理区间内检测到这4个与穗型相关的QTLs，均表现出正向加性效应，即增效位点来自同一个亲本宝大粒。这一结果与表型间高度相关的结果（表4）吻合，说明该区间存在紧密连锁或一因多效的穗型性状QTL。

此外，在第2染色体的InDel标记A105和SRR标记RM14001之间检测到1个穗长QTL qPL2，LOD值为3.76，解释了9.12%的表型变异。在第6染色体的W45和Y48之间检测到影响结实率的QTL qSSR6。

2.3 qNSB7位点的验证

鉴于qNSB7有较大的LOD值和表型贡献率，且该区间存在其他3个相邻穗部性状QTLs，因此将其作为目标QTL作进一步研究。为了避免背景不一致而影响表型鉴定的可靠性，笔者从F2代开始连续利用连锁标记选择杂合体自交，建立1个由151个植株组成的F4分离家系（编号为17-6503的家系），对F2定位结果进行验证。QTL分析显示，qNSB7仍位于RM542和A83标记之间，LOD值为9.84，解释了30.74%的表型变异。并且，其他3个穗型QTLs qSNP7、qNPB7和qPL7都聚集在这个区间，解释了17.2%～24.6%的表型变异（表5）。因此认为，qNSB7在不同世代间可以重演，能稳定遗传。

以RM542标记为参照，分析该家系不同基因型的二次枝梗数、每穗颖花数、一次枝梗数和穗长的数量分布。二次枝梗数呈正态分布， 矮格拉纯合基因型的二次枝梗数分布在 1.0～22.0个范围内，其平均值为（11.45±5.44）个;宝大粒纯合基因型分布在7.3～36.0个范围内，平均值为（21.61±7.55）个;而杂合体的平均值为（18.45±8.44）个，分布范围覆盖了双亲基因型范围，说明qNSB7是1个半显性QTL（图3）。每穗颖花数呈相似的分布特征，矮格拉纯合基因型分布在 34.0～136.5粒范围内，平均值为（89.95±28.01）粒;宝大粒纯合型分布在66.0～181.7粒范围内，其平均值为（124.18±30.15）粒;杂合体的平均值为（110.10±39.26）粒，分布范围覆盖了双亲基因型。一次枝梗数、穗长的分布特征类似于上述性状。因此可以确认qNSB7的定位区间。由于2种纯合型的表型值相互重叠，难以从个体表型值定性判断基因型。尽管在这151个植株中有5个重组型个体，但是仍需要后代群体的平均表型值和变异度来确定基因型。

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