董建国 饶丹 李迎晓

摘要：为了解河南地区猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）的遗传变异情况，采用RT-PCR方法对2015—2017年采自河南省南部地区猪场疑似PDCoV猪肠道内容物中的S和N基因进行扩增和测序，并进行遗传进化分析。结果表明，本次扩增基因间同源性较高，单独成一支，且与我国分离的CH/Sichuan/S27/2012毒株、泰国分离的Swine/Thailand/S5011、美國近些年分离的毒株位于同一分支。近年我国大陆分离的其他毒株和我国香港早期分离的HKU15-44、HKU15-155均位于另一分支，故结果提示河南地区PDCoV发生了一定的变异，该研究结果为本地区PDCoV疫情的防控提供了一定的理论依据。

关键词：猪德尔塔冠状病毒;S基因;N基因;变异分析

中图分类号： S852.65+1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）13-0052-03

冠状病毒能感染多种动物甚至人类，引起呼吸道和肠道疾病。冠状病毒一般可分为α冠状病毒、β冠状病毒和γ冠状病毒3个群，最近国际病毒分类委员会在原有基础上增加了δ冠状病毒群。猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）为α冠状病毒，均能引起猪腹泻、呕吐甚至死亡。2009年，在猪肠道腹泻样品中，研究人员检测出猪冠状病毒，经鉴定为猪δ冠状病毒（PDCov），属于δ冠状病毒群[1]。目前，由冠状病毒引起的猪肠道疾病对我国的养猪业造成了重大损失。2009年，我国香港首次报道在猪腹泻病料中检测到2个猪δ冠状病毒，命名为HKU 15-44和HKU 15-155[1]。2014年2月，美国俄亥俄州农业部宣布美国存在猪δ冠状病毒。1个月后明尼苏达大学首次全基因测序一株猪δ冠状病毒SDVC/USA/Illinois121/2014[2]。此后不久，爱荷华州立大学做出了同样的报道[3]。至2015年1月，美国至少20个州暴发猪δ冠状病毒[4]。2014年4月，韩国出现猪δ冠状病毒[5]。2015年，江西农业大学首次报道我国大陆出现猪δ冠状病毒[6]。

近年来，猪腹泻相关传染病对我国的养猪业造成了重大损失。针对此次猪δ冠状病毒的爆发，河南地区还未有相关分子流行病学调查。因此，本研究以猪δ冠状病毒为研究对象，针对纤突蛋白（S）基因和核蛋白（N）基因进行分子流行病学调查，以掌握我国猪δ冠状病毒的流行现状，为猪δ冠状病毒的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料

针对2015—2017年河南省驻马店和信阳地区猪场疑似暴发猪德尔塔冠状病毒的自然发病猪，采集发病猪肠道组织及腹泻样品于-80 ℃冻存备用，所有试验均在信阳农林学院牧医工程学院动物疾病检测实验室完成。

1.2 主要试剂

病毒DNA/RNA提取试剂盒，购自Magen公司产品;反转录试剂盒，购于Promega公司产品;RT-PCR相关试剂盒，购自ToYoBo生物科技有限公司和Vazyme公司;DNA Marker DL 2000等，购自TaKaRa公司;EB替代染料，购自广州华奇盛生物科技有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中发布的CH SXD12015等猪德尔塔冠状病毒毒株全基因组序列进行生物信息学分析，根据S基因、M基因和N基因保守区域设计扩增其全长的特异性引物序列。引物由江苏苏州金维智生物公司合成。引物信息见表1。

1.4 S和N基因的扩增及克隆

将小肠内容物加入1 mL灭菌PBS混匀，按TRIzol试剂盒操作说明书提取病料组织总RNA。以提取的总RNA为模板，采用AMV反转录酶进行RNA反转录制备cDNA。然后以cDNA为模板，S1F/R、S2F/R、S3F/R、MF/R和NF/R为引物，使用TOYOBO生物科技有限公司高保真酶对目的片段进行扩增。扩增体系为50 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，25 mmol/L MgSO4 3 μL，cDNA模板4 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，RNase Free H2O 28 μL。PCR扩增循环条件：94 ℃ 预变性2 min;98 ℃变性10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s/kb，扩增35个循环;72 ℃延伸10 min。取5 μL的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳观察。PCR阳性样品用凝胶回收后克隆于pEASY-Simple T1 Cloning Vector载体上，阳性重组质粒由江苏苏州金维智生物公司测序。

1.5 序列比对与分析

利用Lasergene及Mega 5.0软件对不同病毒株的S基因和N基因序列构建进化树，PDCov代表毒株的基因序列均下载自GenBank。

2 结果与分析

2.1 病料的RT-PCR检测

采用S和N基因特异性引物扩增出S的3个片段S1、S2、S3和N基因片段，琼脂糖凝胶电泳分析表明，扩增片段大小与预期一致，测序结果表明扩增片段是PDCov，编号分别为ZMD1、ZMD2、ZMD3、XY1、XY2，ZMD代表驻马店地区，XY代表信阳地区（图1、图2、图3、图4）。

2.2 PDCoV S基因进化树的构建

运用分子生物学软件Mega 5.0对测定的S基因序列和国内外具有代表性的序列构建进化树，结果（图5）显示，整个遗传进化树可分为两大分支， 其中扩增的PDCoV S基因与我

国大陆毒株CH/Sichuan/S27/2012、我国台湾毒株Swine/Thailand/S5011和美国毒株PDCoV/USA/Ohio137/2014、8734/USA/IA/2014、SD3424和PDCoV/USA/Illinois121/2014处于同一分支Group Ⅰ，且扩增的S基因单独形成一支。2015年我国分离的PDCoV毒株以及2004年分离的CHN/AH/2004、2014年分离的CHN/HB/2014和2009年我国香港分离的HKU15-44、HKU15-155处于同一分支Group Ⅱ。

2.3 PDCoV N基因进化树的构建

运用分子生物学软件Mega 5.0对测定的N基因序列和国内外具有代表性的序列构建进化树，结果（图6）显示，整个遗传进化树可分为两大分支，其中扩增的PDCoV N基因与我国大陆毒株CH Sichuan/S27/2012、我国台湾毒株Swine/Thailand/S5011和美国毒株PDCoV/USA/Ohio137/2014、8734/USA/IA/2014、SD3424和PDCoV/USA/Illinois121/2014处于同一分支Group Ⅰ，且扩增的N基因单独形成一支。2015年中国分离的PDCoV毒株以及2004年分离的CHN/AH/2004、2014年分离的CHN/HB/2014和2009年香港分离的HKU15-44、HKU15-155处于同一分支Group Ⅱ。

3 讨论

冠状病毒能够引起人、哺乳动物和禽类发病，对公共安全具有潜在威胁。δ冠状病毒是冠状病毒家族的新成员，于2009年首次在香港的野禽中被发现[7]。2014年2月美国在俄亥俄州发现首例PDCoV，随后在20多州的猪群中发现PDCoV[4]。近几年，我国多省份均有PDCoV的报道[8]。笔者所在实验室从2015年9月起对来自河南省不同地区的腹泻病料样品进行PDCoV检测，共检测出5份阳性。

PDCoV基因组全长约25 kb，依次编码3个结构蛋白：纤突蛋白（S）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）[2-3]。PDCoV具有冠状病毒的一般特性，S蛋白在病毒和宿主结合和产生中和抗体等方面起着重要的作用，是冠状病毒主要的抗原蛋白和新型疫苗研究的首选蛋白[8]。N蛋白是冠状病毒的核衣壳蛋白，在细胞因子产生方面发挥作用。根据S蛋白和N蛋白的进化树分析可知，本次扩增的基因之间同源性较高，单独成一支，且与我国大陆分离的CH/Sichuan/S27/2012毒株和我国台湾、美国近些年分离的毒株位于同一分支。与近些年中国分离的其他毒株不在一个分支，这些结果表明河南地区PDCoV发生了一定的变异。

PDCoV与另外2个猪冠状病毒PEDV[9]和TGEV一样，均能引起猪肠道疾病。研究表明，PDCoV感染仔猪后，能够引起仔猪严重腹泻、呕吐、脱水和明显的肠道病变，致死率高达40%[10]。与PEDV不同的是，PDCoV不仅感染肠道，还能够感染肺脏、肾脏和肝脏等多个器官，并引起相应器官不同程度的病变，说明猪PDCoV比PEDV有更高的组织嗜性，并且，PDCoV和PEDV之间没有交叉免疫反应。因此，研制有效的疫苗用于该病的防控是急需解决的问题。目前还没有针对PDCoV的商品化疫苗与诊断试剂。随着研究的深入，相信不久的将来，会有效果很好的PDCoV疫苗和诊断试剂用于控制该病的发生与流行。

参考文献：

[1]Woo P C Y，Lau S K P，Lam C S F，et al. Discovery of seven novel mammalian and avian coronaviruses in the genus Deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source of Alphacoronavirus and Betacoronavirusand avian coronaviruses as the gene source of Gammacoronavirus and Deltacoronavirus[J]. J Virol，2012，86（7）：3995-4008.

[2]Douglas M，Yin J，Jim C，et al. Complete genome sequence of strain SDCV/USA/Illinois121/2014，a porcine Deltacoronavirus from the United States[J]. Genome Announcements，2014，2（2）：e00214-e00218.

[3]Li G W，Qi C，Harmon K M. Full-length genome sequence of porcine Deltacoronavirus strain USA/IA/2014/8734[J]. Genome Announcements，2014，2（2）：e00214-e00278.

[4]Ma Y M，Zhang Y，Liang X E，et al. Origin，evolution，and virulence of porcine Deltacoronaviruses in the United States[J]. mBio，2015，6（2）：e00015-e00064.

[5]Lee S，Lee C. Complete genome characterization of korean porcine Deltacoronavirus strain KOR/KNU14-04/2014[J]. Genome Announcements，2014，2（6）：e01114-e01191.

[6]Song D，Zhou X，Peng Q，et al. Newly emerged porcine Deltacoronavirus associated with diarrhoea in swine in China：identification，prevalence and full-length genome sequence analysis[J]. Transboundary and Emerging Diseases，2015，62（6）：575-580.

[7]Ujike M，Taguchi F. Incorporation of spike and membrane gltcoprotens into coronavirus virions[J]. Viruses，2015，7（4）：1700-1725.

[8]Dong N，Fang L R，Zeng S L，et al. Porcine Deltacoronavirus in mainland China[J]. Emerging Infectious Diseases，2015，21（12）：2254-2255.

[9]俞正玉，逢鳳娇，孙 冰，等. 猪流行性腹泻病毒变异株RT-PCR检测方法的建立[J]. 江苏农业科学，2018，46（1）：116-118.

[10]Chen Q，Gauger P，Stafne M，et al. Pathogenicity and pathogenesis of a United States porcine Deltacoronavirus cell culture isolate in 5-day-old[J]. Virology，2015，482：51-59.