陈慧 庞学丰 李玉玲 吴燕红 黄政治 林菊 陈玲

【摘 要】目的：基于网络药理学方法，对四妙丸治疗类风湿关节炎的作用机制进行探讨和研究。

方法：通过中药系统药理学数据库和分析平台以口服生物利用度和类药性为限定条件，对四妙丸所含化学成分进行筛选并预测作用靶点;通过GeneCards数据库检索类风湿关节炎发病相关的靶点，将四妙丸预测靶点与类风湿关节炎相关靶点导入VENNY 2.1软件，得到共同靶点，即四妙丸作用类风湿关节炎的靶点;通过Cytoscape 3.7.0软件构建成分-靶点网络，并利用软件中Network Analyzer插件分析网络节点度和介数中心度;最后，通过DAVID在线分析工具对靶标进行基因本体（GO）功能富集分析和生物途径（KEGG）通路富集分析。结果：四妙丸共收集52个有效化合物，并作用于14个类风湿关节炎相关的靶点。成分-靶点网络图显示前列腺素G/H合成酶2、转录因子AP-1及肿瘤坏死因子是四妙丸治疗RA的关键靶点，GO功能富集分析显示126个生物过程、8个细胞组成、5个分子功能，KEGG通路富集分析显示35条通路。结论：四妙丸通过一氧化氮生物合成过程的正调节、钙调蛋白1-单加氧酶活性的正调节、发热的正调节、炎症反应等生物过程，并涉及细胞因子活性、生长因子活性、酶结合等分子功能发挥治疗类风湿关节炎的作用，且肿瘤坏死因子信号通路的调控是四妙丸治疗类风湿关节炎的关键机制之一。

【關键词】 关节炎，类风湿;四妙丸;网络药理学;作用机制

On the Mechanism of Simiao Wan（四妙丸）in the Treatment of Rheumatoid Arthritis Based on Network Pharmacology

CHEN Hui，PANG Xue-feng，LI Yu-ling，WU Yan-hong，HUANG Zheng-zhi，LIN Ju，CHEN Ling

【ABSTRACT】Objective：Based on the network pharmacological method，to explore the mechanism of

Simiao Wan（四妙丸）in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：The chemical constituents of Simiao Wan were screened and the targets were predicted by TCMSP database with oral bioavailability and pharmacokinetics as the limiting conditions.The targets related to rheumatoid arthritis were retrieved by GeneCards database，and the predicted targets of Simiao Wan and targets related to rheumatoid arthritis were put into the VENNY 2.1 software to get the common targets，namely the targets of Simiao Wan for rheumatoid arthritis.The component-target network was constructed by Cytoscape 3.7.0 software，to analyze the network node degree and the median centrality by using Network Analyzer plug-in software.Finally，functional enrichment analysis of gene ontology and KEGG pathway enrichment analysis were made by DAVID.Results：A total of 52 effective compounds were collected from Simiao Wan and acted on 14 targets related to rheumatoid arthritis.Component-target network showed that prostaglandin G/H synthase 2，transcription factor AP-1 and tumor necrosis factor were the key targets of Simiao Wan in the treatment of rheumatoid arthritis.GO functional enrichment analysis showed 126 biological processes，8 cell components and 5 molecular functions.KEGG pathway enrichment analysis showed 35 pathways.Conclusion：Simiao Wan can play a role in the treatment of rheumatoid arthritis through the positive regulation of nitric oxide biosynthesis，calmodulin-1-monooxygenase activity，positive regulation of fever，inflammatory reaction and other biological processes，involving the molecular functions of cytokine activity，growth factor activity，enzyme binding，and so on.The regulation of signal pathway is one of the key mechanisms of Simiao Wan in the treatment of rheumatoid arthritis.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid;Simiao Wan（四妙丸）;network pharmacology;mechanism of action

类风湿关节炎（rheumatoed arthritis，RA）是一种以滑膜增生、关节破坏为主要特征的自身免疫系统疾病，临床上常见对称性小关节肿痛，发病过程中常伴关节外表现的结缔组织病变。有研究显示，RA在全球的发病率为0.5%～1.0%，我国患病率为0.42%[1]。临床显示，女性RA患病率显著高于男性。随着病情的发展，可能会导致残疾。西医学治疗RA主要运用非甾体抗炎药、改善病情抗风湿药及糖皮质激素等，这些药物虽能缓解病情，但不良反应颇多。四妙丸是治疗湿热阻络型RA的经典方剂，不仅能减轻湿热阻络型RA患者的症状，改善患者各项指标及关节功能，而且不良反应发生率低[2-3]。

四妙丸出自清·张秉成《成方便读》，由苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁组成。生物碱是黄柏最重要的活性物质，具有抗菌、改善关节软骨代谢免疫抑制及抑制细胞免疫反应等多方面的作用[4]。苍术在《神农本草经》中被列为上品[5]，具有抗炎，抗肿瘤，免疫调节，改善消化系统、心血管系统和神经系统功能等多方面的药理作用[6-7]。牛膝具有抗炎、镇痛、调节免疫、抗肿瘤、抗骨质疏松等药理作用[8]。薏苡仁具有镇痛、抗炎、抗血栓形成、提高机体免疫力、抗肿瘤等作用[9]。现代药理学对四妙丸中单药的作用研究颇多，但对于四妙丸治疗RA的多成分、多靶点、多通路作用机制研究尚不全面。本文基于网络药理学方法，从分子水平阐明四妙丸的有效化合物、有效化合物和靶点以及靶点和疾病之间的机制，进一步为四妙丸治疗RA的作用机制提供方法依据和理论基础。

1 研究方法

1.1 四妙丸所含化合物的收集与筛选 通过中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）收集四妙丸中苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁的化合物，并以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性

（DL）≥0.18[10]为限定条件对所收集到的化合物进行筛选。

1.2 四妙丸所含化合物作用靶点的预测 对1.1中化合物的作用靶点进行预测，并去重。由于部分预测靶点名称不规范，所以将预测靶点导入STRING 10.5数据库进行校正，选择“homo sapiens”，获得预测靶点及对应的标准基因名。

1.3 RA发病靶点检索及四妙丸作用RA相关靶点的预测 通过GeneCards数据库检索RA发病相关的靶点，取得分≥20分的靶点。将四妙丸预测靶点与RA相关靶点导入VENNY 2.1软件，得到共同靶点，即四妙丸作用RA的靶点。

1.4 四妙丸所含化合物作用RA相关靶点相互作用的网络构建 将每个化合物与其作用的RA靶点相联系，通过Cytoscape 3.7.0软件进行四妙丸的成分-RA相关靶点相互作用网络的构建并绘制网络图，并利用软件中的Network Analyzer插件分析网络节点度和介数中心度。

1.5 四妙丸对RA作用靶点的PPI网络构建 为了获得四妙丸对RA作用靶点之间的联系，将预测的四妙丸作用RA的靶点上传至STRING 10.5数据库（https：//string-db.org），选择研究物种为人类，设置靶点之间最低要求联系分数为0.4，并隐藏不与其他靶点联系的靶点，获得靶点联系网络图。将该图进一步导入Cytoscape 3.7.0软件进行拓扑学分析并构建PPI网络。

1.6 四妙丸治疗RA预测靶点富集分析 运用DAVID数据库，以P < 0.05作为筛选条件获得靶点蛋白进行基因本体（GO）功能富集分析及生物途径（KEGG）通路富集分析。选择生物过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（ molecular function）3个部分绘图。使用GraphPad Prism 7.0将GO功能富集分析中生物过程的前20个条目、细胞组成、分子功能的条目做成可视化条形图。利用Omicshare将得到的KEGG结果制作成高级气泡图。

2 结果与分析

2.1 四妙丸所含化合物的收集与筛选结果 筛选出四妙丸的活性化合物共52个，其中黄柏25个，苍术4个，牛膝17个，薏苡仁6个。

2.2 四妙丸所含化合物作用靶点的预测结果

2.1中52个化合物共检索出830个预测靶点，并去重。将预测靶点导入STRING 10.5数据库进行校正，获得494个预测靶点及对应的标准基因名。

2.3 RA相关靶点检索及四妙丸作用RA相关靶点的预测结果 通过GeneCards数据库共检索出3528个与RA相关的靶点，相关度最高的靶点是白细胞介素（IL）-6，得分为103.41分，相关度最低的靶点是LOC108684022（FRAXA Repeat Instability Region），得分为0.21分。得分≥20分的靶点共144个。将四妙丸52个有效化合物所对应的494个预测靶点与144个RA相关靶点导入VENNY 2.1软件，共得到14个共同靶点，即四妙丸作用RA的靶点，见图1。

2.4 四妙丸有效化合物作用RA相关靶点相互作用的网络构建结果 將每个化合物与其作用的RA靶点相联系，通过Cytoscape 3.7.0软件做出化合物-靶点联系图，见图2。利用软件中自带的Network Analyzer插件分析网络节点度（degree）和介数中心度（betweenness）。数值越高，表明所对应化合物或靶点在网络中越重要。图2中化合物槲皮素（网络节点度= 14，介数中心度 = 0.374 34）、汉黄芩素（网络节点度= 6，介数中心度 = 0.064 34），靶点前列腺素G/H合成酶2（PTGS2，网络节点度 = 27，介数中心度 = 0.821 94），转录因子AP-1（JUN，网络节点度 = 4，介数中心度 = 0.013 59），肿瘤坏死因子（TNF，网络节点度= 4，介数中心度= 0.013 59），说明它们在网络中起关键作用，是四妙丸治疗RA的主要有效化合物和靶点。

2.5 四妙丸对RA作用靶点的PPI网络构建结果 根据1.5中要求，STRING 10.5数据库获得14个靶点之间共81条联系的网络图。将图导入Cytoscape 3.6.1软件进行拓扑学分析得出联系其他靶点个数排名前6位的靶点依次是血管内皮生长因子A（VEGFA，13个）、TNF（13个）、IL-6（13个）、JUN（13个）、IL-1B（12个）、PTGS2（12个）。四妙丸对RA作用靶点的PPI网络图见图3。

2.6 四妙丸治疗RA预测靶点富集分析结果 把生物过程中前20条目、分子功能和细胞组成的条目绘制成条形图，见图4。

其中生物过程分析得到126个条目，细胞组成分析得到8个条目，分子功能得到5个条目。在生物过程分析中，一氧化氮（NO）生物合成过程的正调节、钙调蛋白1-单加氧酶活性的正调节、发热的正调节、炎症反应、ERK1和ERK2级联的正调节等排位靠前;在细胞组成分析中，主要包括细胞外空间、细胞外区域、质膜外侧等;在分子功能分析中，包括细胞因子活性、生长因子活性、酶结合、内肽酶活性及金属内肽酶活性。KEGG通路富集分析显示共35条通路，取前20条通路制作KEGG高级气泡图见图5，结果显示，四妙丸治疗RA的机制中TNF信号通路被显著性富集。其中四妙丸作用于TNF通路排名靠前的化合物为槲皮素和汉黄芩素，见表1。与TNF信号通路相关的靶点有9个，分别是VCAM-1、IL-6、TNF、CCL-2、PTGS-2、JUN、IL-1B、MMP-3、SELE，其中PTGS2（网络节点度 = 27，介数中心度 = 0.821 94）。节点度和介数中心度数值较高，是TNF通路中的关键靶点。此外，JUN（网络节点度 = 4，介数中心度 = 0.013 59）和TNF（网络节点度= 4，介数中心度= 0.013 59）也是该通路的主要靶点，与RA发生的机制密切相关。见表2。

3 讨 论

RA是一种以关节滑膜炎症为主要病理表现的慢性自身免疫性疾病。本研究发现，槲皮素及汉黄芩素是四妙丸至关重要的有效化合物，TNF、IL-6、VEGFA、PTGS2、JUN是四妙丸治疗RA的关键靶点。有研究表明，100，200，400 mg·kg-1的槲皮素灌胃能明显减轻急性痛风性关节炎大鼠的关节炎症反应，且对肝功能无损害[11]。槲皮素也能下调基质金属蛋白酶-13/金属蛋白酶组织抑制剂-1的比例，促进抑制软骨细胞外基质的降解，保护关节软骨[12]。此外，槲皮素还有综合抗氧化能力，能通过多种途径对多种肿瘤均具有抗癌特性[13]。大量体内外实验研究显示，汉黄芩素能抑制诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2（COX-2）的诱导，以及选择性地抑制COX-2来减NO和前列腺素E2（PGE2）的产生，从而发挥抗炎作用[14-15]。

在四妙丸作用RA的14个靶点中，有2组靶点之间的联系程度较高。第1组靶点是TNF、IL-6、IL-1B，均属于炎性细胞因子，在RA滑膜病变中起核心作用。第2组靶点是VEGF，有强大的促血管增生和增强血管通透性的功能。滑膜血管翳是RA的基本病理改变，是在慢性滑膜炎的基础上形成的。它的形成与VEGF及其受体介导的血管新生密切相关，并存在于RA整个病理过程中。这2组靶点能较好地阐释四妙丸治疗RA的作用机制。

在GO富集生物过程和分子功能中，NO生物合成过程的正调节、细胞因子活性具有显著意义并排位第一。NO是一种高度反应性的细胞毒性自由基，在各种疾病中都与组织损伤有关。在体外，NO对软骨细胞的功能有害，包括抑制胶原蛋白和蛋白聚糖的合成，加快细胞凋亡。有研究显示，RA患者血清及关节液中NO含量增高，说明NO与RA的发病密切相关[16-17]。关节滑膜中高浓度的NO不仅使滑膜和软骨组织损伤，并且使血管壁的通透性增加而引起渗出，滑膜肿胀、充血，使进入组织中的巨噬细胞及中性粒细胞等释放活性细胞因子共同参与滑膜的损伤。由于RA患者关节滑膜液中存在高浓度的TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性细胞因子刺激滑膜组织、滑膜细胞过度表达COX-2，

引起PGE2及NO大量合成和释放，而四妙丸所含的有效化合物能抑制COX-2在炎症关节的表达与合成，故能明显缓解RA患者的临床症状。

TNF信号通路是四妙丸治疗RA发病机制的重要通路。TNF因子在调节免疫功能的同时，过量可造成对组织的损伤[18]，能与其他促炎性细胞因子导致骨和软骨的破坏[19]，也能抑制各种生长因子对软骨细胞的促有丝分裂作用。本研究发现，四妙丸能通过作用于TNF、IL-6、VEGFA、PTGS2、JUN等14个靶点而对RA发挥作用，且有9个靶点显著富集到TNF信号通路，从而推知，四妙丸能通过调控TNF信号通路的表达，发挥抗炎镇痛作用，从而达到缓解临床症状，治疗RA的目的。此外，从图2中还可以看出，同一种药物成分往往作用于多个靶点，每个靶点至少与2个以上的化合物相联系，例如黄柏与牛膝的药物成分槲皮素与14个靶点均有作用，苍术与黄柏的药物成分汉黄芩素与6个靶点均有联系等，这些结果体现了中药复方多成分、多靶标的作用特点。

本研究通过中药活性成分的筛选、靶点预测、网絡构建与分析，从“药物-靶点-疾病”关联性对四妙丸治疗RA的相关作用机制进行分析，找出槲皮素及汉黄芩素是四妙丸至关重要的有效化合物，TNF、IL-6、VEGFA、PTGS2、JUN是四妙丸治疗RA的关键靶点，TNF信号通路是四妙丸治疗RA发病机制的重要通路。本研究表明，四妙丸治疗RA呈现出的多分子、多靶点协同作用优势明显，并为临床研究提供方法依据和理论基础，将进一步加大对其研究。

4 参考文献

[1] CHUNG IM，KETHARNATHAN S，THIRUVENGADAM M，et al.Rheumatoid Arthritis：The Stride from Research to Clinical Practice[J].Int J Mol Sci，2016，17（6）：E900.

[2] 胡显海.四妙丸治疗活动期风湿关节炎临床研究[J].中医临床研究，2015，7（7）：103-104.

[3] 曹雯，孙洪平，曹琳，等.四妙散的临床运用及作用机制[J].吉林中医药，2017，37（10）：976-979.

[4] 陈阳峰，钟晓红.黄柏的药理作用及其活性成分提

取[J].作物研究，2015，29（5）：564-568.

[5] 胡世林.苍术的本草考证[J].中国医药学报，2001，16（1）：11-13，81.

[6] 张明发，沈雅琴.苍术抗炎、抗肿瘤和免疫调节作用的研究进展[J].药物评价研究，2016，39（5）：885-890.

[7] 白忠旭，刘玉强，才谦，等.四妙丸用生苍术与用麸炒苍术的药效学比较研究[J].中草药，2013，44（18）：2577-2580.

[8] 田硕，苗明三.牛膝的化学、药理及应用特点探讨[J].中医学报，2014，29（8）：1186-1188.

[9] 吴岩，原永芳.薏苡仁的化学成分和药理活性研究进展[J].华西药学杂志，2010，25（1）：111-113.

[10] LI J，ZHAO P，LI Y，et al.Systems pharmacology-based dissection of mechanisms of Chinese medicinal formula Bufei Yishen as an effective treatment for chronic obstructive pulmonary disease[J].Sci Rep，2015，15（5）：15290.

[11] 黄敬群，刘久红，李伟中，等.槲皮素对急性痛风性关节炎大鼠的治疗作用及其对肝功能的影响[J].山东医药，2015，55（28）：27-29.

[12] 袁小亮，李林福，施伟梅，等.槲皮素对关节软骨中MMP-13、TIMP-1表达的影响[J].时珍国医国药，2016，27（2）：283-285.

[13] 马纳，李亚静，范吉平.槲皮素药理作用研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2018，20（8）：221-224.

[14] CHI YS，LIM H，PARK H，et al.Effects of wogonin，a plant flavone from Scutellaria radix，on skin inflammation：in vivo regulation of inflammation-associated gene expression[J].Biochem Pharmacol，2003，66（7）：1271-1278.

[15] PARK BK，HEO MY，PARK H，et al.Inhibition of TPA-induced cyclooxygenase-2 expression and skin inflammation in mice by wogonin，a plant flavone from Scutellaria radix[J].Eur J Pharmacol，2001，425（2）：153-157.

[16] FARRELL AJ，BLAKE DR，PALMER RM，et al.Increased concentrations of nitrite in synovial fluid and serum samples suggest increased nitric oxide synthesis in rheumatic diseases[J].Ann Rheum Dis，1992，51（11）：1219-1222.

[17] 王強，徐玉川，董巍.全身调控一氧化氮水平对大鼠佐剂性关节炎的影响[J].中华风湿病学杂志，2002，6（3）：209-210.

[18] LIU R，MA M，CUI M，et al.Effects of tumor necrosis factor-β（TNF-β）252A > G polymorphism on the development of migraine：a meta-analysis[J].PLoS One，2014，9（6）：e100189.

[19] ZHANG LL，WEI W.Study of therapeutic drugs on molecular targets in rheumatoid arthritis[J].Chin Pharmacol Bull，2006，22（11）：1291-1296.

收稿日期：2019-03-24;修回日期：2019-05-08