伍嘉宝， 刘晓华， 张欣宗， 唐运革， 秦卫兵△

国家卫生健康委员会男性生殖与遗传重点实验室、广东省计划生育科学技术研究所 1中心实验室， 2男性科(广东广州 510600)

不孕不育已逐渐成为全球性的健康问题，不孕不育的男性因素约占45%～50%，而精子质量异常是男性不育的重要因素之一[1]。弱精子症作为精子质量异常最常见的类型，是困扰许多育龄夫妇的一个重要问题。根据WHO《人类精液实验室检验手册》第五版诊断标准，弱精子症是指精液参数中前向运动精子百分率<32%的病症，其病因复杂。已知的弱精子症主要病因有生殖系统炎症、内分泌失调、免疫因素、精索静脉曲张、微量元素缺乏等因素，但有相当一部分弱精子症患者的病因不明，目前药物不能很好地改善弱精子症患者的精液质量，弱精子症的发病机制有待深入研究。文献报道烟碱样乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs)存在于人类及小鼠精子，小鼠精子nAChRs表达降低与精子活力降低有关[2-3]。目前，国内外尚未有人精子nAChRs与精子活力相关性报道。本文研究了烟碱样乙酰胆碱受体在弱精子症精子与正常精子中的表达差异，旨在为开发新型治疗弱精子症药物提供基础理论和实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年8月至2019年5月广东省计划生育科学技术研究所(广东省计划生育专科医院)部分就诊患者精液标本，应用计算机辅助精子分析系统行精液分析，按照入组标准选择入组。弱精子症入组标准：根据WHO《人类精液实验室检验手册》第5版诊断标准，连续3次检测前向运动率<32%，其他精液常规参数(液化时间、精液量、精子浓度、形态、pH值)无异常。排除标准：其他精液常规参数(液化时间、精液量、精子浓度、形态、pH值)异常，临床病历资料不全。正常精液标准：根据WHO《人类精液实验室检验手册》第5版诊断标准，连续3次检测前向运动率≥32%，其他精液常规参数(液化时间、精液量、精子浓度、形态、pH值)无异常。本实验弱精子症组入组31例，年龄(28.16±6.12)岁；正常对照组36例，年龄(27.77±4.56)岁。本研究经广东省计划生育专科医院伦理委员会审查批准。

1.2 主要试剂 nAChRA7兔抗人抗体IgG(Abcam)，山羊抗兔抗体IgG(Bioworld)，乙酰胆碱(MCE)，Percoll密度梯度液(GE Healthcare)，RIPA(Thermo Fisher)，蛋白酶抑制剂(MCE)，Tris-甘氨酸电泳缓冲液、TBST液(Solarbia)，Trans-blot TURBO转膜套装(Biorad)。

1.3 Western blot检测弱精子症及正常精子中nACh受体表达 Percoll密度梯度离心法纯化分离精子，取分离纯化后的精子细胞沉淀，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上裂解30 min，4℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清液，BCA 法进行蛋白定量。制备10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，兔抗人一抗nAChRA7 IgG(1∶ 700，Abcam) 4℃孵育过夜，辣根标记山羊抗兔IgG (1∶ 5 000，Bioworld) 37℃孵育1 h，洗涤后于凝胶成像系统显示目的条带，采集数据。

1.4 计算机辅助的精液分析系统分析精子的运动参数 观察添加乙酰胆碱前正常精液和弱精子症精液精子运动参数。……