罗燕燕，刘效栓△，王红丽，肖正国，顾秀琰，张中华，朱 平，张柏桃，台永利

1.甘肃省中医院药学部(兰州 730050)；2.甘肃省药品检验研究院(兰州 730070)；3.海思科医药集团(成都 610000)

据估计，我国每年有数万吨的甘草废渣没有被资源化利用而浪费[1]。研究发现，甘草药渣是一种宝贵的可再利用资源[2]，其中仍含有大量的黄酮[3]，而其中富含的黄酮有显著的抑菌、抗炎、抗溃疡、抗氧化、抗自由基、降血脂、解痉镇痛等药理活性[4-8]。

大孔吸附树脂是自20世纪60年代兴起的，可用于黄酮的分离纯化，是一类普遍应用于医药、食品、环保等领域的有机高聚物吸附剂[9-11]。聚酰胺树脂法则是近几年在分离纯化黄酮类物质上有较好的应用，具操作简单、效率高、成本低、稳定性好和再生简便等优点[12]。易运红等[13]采用5种大孔吸附树脂ADS-7、D101、HPD-300、HPD-910和AB-8分离纯化甘草黄酮，并考察了样品浓度、洗脱剂乙醇浓度及用量等影响吸附性能的因素，得出ADS-7树脂对黄酮类化合物有较好的吸附纯化作用；张志东[14]分别选择了AB-8、Dml30、SP825三种大孔树脂进行甘草黄酮的吸附和解吸，通过对三种树脂在同一条件下的平衡浓度、吸附量、解吸率等关键指标进行比对，最终选用SP825大孔树脂为后续实验材料。杨少娟等[15]通过比较不同条件下聚酰胺树脂对甘草黄酮的静态吸附和动态吸附的效果，确定了甘草黄酮分离纯化的最佳条件；李俊松等[16]研究聚酰胺富集甘草中黄酮的工艺参数，最终确定最佳纯化工艺条件为：甘草聚酰胺比2∶1(g/g)，树脂径高比1∶7，用 5倍量柱体积70%乙醇洗脱，甘草黄酮洗脱率在90%左右。

本研究通过大孔吸附树脂ADS-7、AB-8 和聚酰胺3种吸附树脂，静态吸附、解吸试验，及ADS-7树脂动态吸附解吸试验，优化出了分离纯化甘草总黄酮的最佳工艺，为进一步研究提供依据。

仪器与试药

1 仪器 UV-1800紫外可见分光光度计(日本岛津)；AR124CN 型电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)；SB-3200D型超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；ZXFD-A5140型全自动新型鼓风干燥箱(上海智诚分析仪器制造有限公司)；DZF-6090型减压干燥箱(上海乔跃电子有限公司)；SHA-C水浴恒温震荡器(金坛市佳美仪器有限公司)；砂芯层析柱(2.1cm×30cm，天津市大茂化学试剂厂)。

2 试药 甘草饮片(甘肃康乐药业有限责任公司批号：150922，150701，经甘肃省药检院宋平顺主任药师鉴定为Glycyrrhiza uralensis Fisch)、自制甘草渣(批号：150922，150701)得总黄酮提取物(批号：20160504、20160505、20160506)、甘草苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：B20414，纯度≥98%)、ADS-7型大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)、AB-8型大孔吸附树脂(上海润捷化学试剂有限公司)、聚酰胺(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、氢氧化钾均为分析纯。

方法与结果

1 总黄酮含量测定

1.1 对照品溶液的制备：取甘草苷对照品适量，精密称定，置10 ml量瓶中，加70 %乙醇稀释至刻度，配制成0.830 mg/ml，摇匀即得。

1.2 供试液的制备：取总黄酮提取物(批号：20160504)适量，研细取8 g，精密称定，置1000 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度线，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，取出，放冷，用70%乙醇标定，摇匀即得。

1.3 检测波长的确定：取对照品溶液、供试液各0.1 ml，分别加10%氢氧化钾溶液0.1 ml，显色5 min，用70%乙醇稀释至5 ml，在波长800～200 nm中扫描，记录λ值[17]，最终选择对浓度相对稳定的峰λmax336 nm为测定波长。

1.4 标准曲线的绘制：取对照品溶液2.5 ml至25 ml容量瓶中，加10%氢氧化钾溶液2.5 ml，放置5 min，用70%的乙醇定容至刻度。精密吸取0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.2 ml置10 ml容量瓶中，用70%的乙醇定容至刻度；在336 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程y=64.458x-0.0048(r=0.9997)，线性范围：4.98～9.96μg/ml。测量的吸光度值见表1。

表1 总黄酮标准曲线结果

1.5 样品含量测定：取三批总黄酮提取物(批号：20160504，20160505，20160506)适量，精密称定，置10 ml容量瓶中，加70 %乙醇至刻度线，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，取出，放冷，用70 %乙醇标定，摇匀后取0.5 ml至10 ml容量瓶，加入10 %氢氧化钾溶液0.5 ml，显色5 min，定容至刻度，在336 nm处测定吸光度并计算含量，见表2。

表2 三批总黄酮提取物中总黄酮含量

2 吸附树脂的筛选 以吸附率、解吸率为评价指标，优选ADS-7型大孔吸附树脂、AB-8型大孔吸附树脂及聚酰胺吸附树脂。计算公式如下：

Q=(C0-C1) ×V1/W (1)

E (%)=(C0-C1) /C0×100% (2)

D(%)=C2V2/[(C0-C1) ×V1]×100 % (3)

以上公式中：Q为吸附量(mg/g湿树脂)；E为吸附率(%)；D为解吸率(%)；C0为样品起始质量浓度、C1为平衡液黄酮质量浓度、 C2为解吸后料液黄酮质量浓度(mg/ml)；V1为吸附溶液体积、V2为解吸溶液体积(ml)；W为树脂质量(g)。

2.1 树脂预处理：称取3种型号树脂适量，分别加入3 BV 95 %乙醇放置24 h，至充分溶胀。将浸泡后的树脂湿法加入层析柱中，以95 %乙醇冲洗至流出液加水无白色浑浊，去离子水洗脱至流出液无醇味；2～3 BV 5% 盐酸溶液洗层析柱，并浸泡2 h，去离子水洗至中性；2～3 BV 5 % 氢氧化钠溶液洗层析柱，并浸泡2 h，去离子水洗至中性，浸泡于95%乙醇中备用。

2.2 静态吸附与解吸试验：称取“2.1”项下备用的三种树脂各2.0 g(抽干状态)， 至250 ml 具塞锥形瓶中，分别加入25 ml“2.1”项下供试液(8 mg/ml)，盖上塞子，于水浴振荡器中振荡24 h，测定此时溶液中总黄酮的含量，按式(1)、(2)计算吸附量(Q)和吸附率(E)。过滤掉锥形瓶内溶液，再加入30 ml 70%的乙醇，具塞振荡洗脱24 h，待充分解吸后，测定此时解吸液中总黄酮的含量，按式(3)计算解吸率(D)，以确定最佳吸附树脂。

通过对三种树脂：ADS-7、AB-8、聚酰胺进行静态吸附及解吸效果测定，结果见表3。

结果显示，ADS-7型大孔吸附树脂有较高的吸附率，为89.63%，但其解吸率为73.26%，略低于AB-8型大孔吸附树脂的，考虑到AB-8型吸附率较低，而解吸率是基于吸附效果而言的，综合考量，确定ADS-7为纯化甘草黄酮的最佳树脂。

表3 三种树脂对样液中总黄酮静态吸附和解吸结果

2.3 ADS-7大孔吸附树脂动态吸附与解吸试验

2.3.1上样液pH对甘草黄酮吸附效果的影响 取五份供试液(8mg/ml)适量，调pH分别为1、3、5、7、9，上样量各6 BV(树脂体积倍数)、流速2 BV/h 过大孔树脂柱，分别收集残液并准确记录体积，测定吸光度，计算吸附量、吸附率，选择最佳pH值。黄酮吸附率随样液pH值增大呈上升趋势，而当pH>7时，有所下降，原因是黄酮与树脂的结合是以氢键的方式，碱性条件下，酚羟基上的氢解离成酸根离子，从而降低了与树脂的结合[18]。同时，随着pH 升高流出液的颜色明显加深，原因是黄酮样液中存在多为酚类物质的色素，在碱性条件下色素转化为盐而溶于水，不易被树脂吸收。综合考量吸附率和色素残留量[19]，最终选取样液pH 值为7。上样液不同pH对甘草黄酮吸附效果的影响见表4。

2.3.2 上样液浓度对甘草黄酮吸附效果的影响：取5支层析柱，分别将浓度为7、7.5、8、8.5、9 mg/ml的总黄酮提取物溶液用5 % NaOH溶液调至pH=7，每种浓度 6 BV，以 2 BV/h 流速上样，同上计算吸附量、吸附率，选取合适的上样浓度。浓度为8 mg/ml时，具有较高的吸附率，从表5看出，随着浓度升高，吸附量依次增大，但超过树脂吸附饱和度后，样液有所泄漏，故上样液浓度选择8 mg/ml为宜。吸附效果的影响见表5。

表4 五份不同样液pH值对甘草黄酮吸附的影响

表5 五份不同样液浓度对甘草黄酮吸附的影响

2.3.3 上样液流速对甘草黄酮吸附效果的影响：取5支层析柱，将8 mg/ml pH=7的上样液分别以1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 BV/h 流速进行动态吸附，每次2 h，收集流出液，计量体积，测定其中黄酮的吸光度，计算吸附率，以选取最佳上样流速，不同上样流速对甘草黄酮吸附效果的影响见表6。上样流速>2.5 BV/h后，黄酮吸附率明显下降，原因是流速过快不利于吸附的进行，样液有泄漏；流速较慢时虽保证了黄酮在树脂内部的扩散，进而提高吸附率，但耗时长。最终确定上样流速为2.5 BV/h。

2.3.4 上样量对甘草黄酮吸附效果的影响：分别取8 mg/ml pH=7的上样液 3～7 BV，以2.5 BV/h进行吸附试验，测定大孔树脂对甘草黄酮的吸附效果，以确定最佳上样量，不同上样量对甘草黄酮吸附效果的影响见表7。可见上样量>5 BV 后，吸附率趋于平稳，增加上样量只会浪费成本，故选择最佳上样量为5 BV。

表6 五份不同上样流速对甘草黄酮吸附的影响

表7 五份不同上样量对甘草黄酮吸附的影响

2.3.5 洗脱剂浓度对甘草黄酮解吸效果的影响：取5份8mg/ml 5 BV样液，分别加入 5 根树脂柱，以2.5 BV/h流速通过后，用6 BV体积分数50 %、60 %、70 %、80 %、90 %的乙醇洗脱，解吸速率统一为2 BV/h，计算收集液中黄酮解吸率，解吸效果的影响见表8。黄酮解吸率随乙醇浓度增大总体呈上升趋势，而当浓度为80 %时，吸附率达到最高，吸附效果最佳，因此确定80 %乙醇为解吸剂。

2.3.6 洗脱速率对甘草黄酮解吸效果的影响：取5 份 8 mg/ml的样液5 BV，分别加入备好的树脂柱内，以 2.5 BV/h 流速吸附后，用6 BV体积分数 80%乙醇以1.5、2、2.5、3、3.5 BV/h 速率洗脱，测定洗脱液中黄酮含量并计算黄酮解吸率，结果见表9。随着洗脱速率的增加，解吸率曲线逐渐上升，而当流速>3 BV/h后，由于解吸过快，导致洗脱不充分而降低解吸率，曲线反而下降。故确定3 BV/h为最佳洗脱速率。

2.3.7 洗脱剂用量对甘草黄酮解吸效果的影响：取 5 份8 mg/ml的样液5 BV，分别上备好的树脂柱，以 2.5 BV/h流速吸附后，用80 %乙醇，3、4、5、6、7 BV量，3 BV/h 速率洗脱，测定洗脱液中黄酮含量，计算解吸率，结果见表10。随着洗脱剂用量的增加，黄酮解吸率先呈上升趋势，当>5 BV后，解吸曲线增幅较缓，洗脱量在6 BV时，解吸效果最好，再增加洗脱剂用量除了增加成本对解吸并无多大实际意义，综合考虑解吸率和节省溶剂，确定6 BV为最佳洗脱用量。

表8 五份不同浓度洗脱剂对甘草黄酮解吸的影响

表9 五份不同洗脱速率对甘草黄酮解吸的影响

表10 五份不同洗脱剂用量对甘草黄酮解吸的影响

综上，甘草渣中总黄酮提取物的树脂纯化工艺方法确定为：取 pH值为7，样液浓度为8 mg/ml的甘草总黄酮供试液5 BV，以 2.5 BV/h流速上样后，用体积分数为80 %的乙醇溶液6 BV以3 BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，即得。

2.4 总黄酮干燥工艺筛选：洗脱液回收乙醇后减压浓缩至相对密度为1.10～1.15(25 ℃)的浸膏，分别进行常压干燥(80 ℃)、减压干燥(真空度<0.06 Mpa，温度<60 ℃)、微波干燥(温度<60 ℃，5 min)，对干燥物的性状、溶化性定性检查，并测定总黄酮的含量。结果见表11。

表11 干燥工艺条件的优选结果

结果表明，微波干燥所得干燥物其性状、溶化性、总黄酮含量均较常压干燥、减压干燥好，而且干燥时间短，故干燥工艺采用微波干燥法。

2.5 验证试验：为了验证上述结果的准确性，保证纯化工艺的合理可行，按照优选的工艺参数将不同批次(20160504、20160505、20160506)总黄酮提取物制样后通过预处理好的ADS-7型大孔吸附树脂并洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度为1.10～1.15(25 ℃)的浸膏，微波干燥(温度<60 ℃，5 min)，计算总黄酮含量，结果见表12。

表12 不同批号总黄酮提取物纯化效果比较(n=3)

可见ADS-7型大孔树脂对甘草黄酮的纯化效果显著，微波干燥方法合理可行，表明优化的工艺精制率高，稳定可靠，具可操作性和重现性。

讨 论

1 聚酰胺树脂的局限性 聚酰胺吸附机理为H键吸附，对黄酮在酸性条件下吸附较好，但过酸的条件下不利于总黄酮的洗脱[20]。通过试验得出，甘草渣中总黄酮提取物所制样液在聚酰胺树脂上吸附效果极差，原因可能是样液pH为5所致。虽然可通过调节样液pH来确定聚酰胺吸附总黄酮的最佳pH及吸附率，但聚酰胺存在粉性强、易耗损、阻塞柱子等问题，因此该实验选用大孔吸附树脂做进一步研究。

2 检测波长的选择 2015年版《中国药典》未收载甘草总黄酮含量测定方法。文献报道甘草总黄酮含量测定方法众多，而以甘草苷为对照品、氢氧化钾为显色剂最为推荐，但选择的吸收波长各不相同。高红等[21]采用紫外分光光度法测定甘草总黄酮的含量，以甘草苷为对照品，10 %氢氧化钾为显色剂，最大吸收波长407 nm；冯薇等[22]研究甘草总黄酮含量测定方法，甘草苷对照品及样品溶液经碱处理后，最大吸收波长为334 nm；本研究在预试验中做了大量筛选，发现随着浓度不断稀释，对照品溶液显色后的最大吸收波长蓝移。而要控制吸光度在0.3～0.7 范围内，其浓度范围比较窄(4.48～9.96 )μg/ml，最大吸收波长在336 nm 处。

3 pH对紫外吸收的影响 体系的pH对紫外吸收光谱的影响较为普遍，包括对酸性、碱性亦或中性物质都有明显的影响[23]。而当前对于甘草总黄酮含量的测定普遍用紫外可见分光光度法。因此，建议在未来科学研究中，流动注射法-化学发光、电化学法、免疫化学发光等这些灵敏度高的分析检测方法应逐步被用于中药总黄酮的含量测定[24]。