尿血宁合剂中红景天苷和木樨草苷的含量测定

2019-10-23赵跃荣

中国卫生标准管理 2019年17期

赵跃荣

尿血宁合剂为我院的中药制剂，由女贞子、墨旱莲、小蓟、生侧柏、马鞭草、石韦等药物制成，本药物具有滋阴补肾、凉血止血的功效，临床用于肾炎血尿（含镜下血尿）[1]。本方中女贞子为君药，具有补肝肾、强腰膝的功效。红景天苷是女贞子保护肾脏功能的重要活性成分[2]。墨旱莲为臣药，具有凉血止血、收敛止痒、补益肝肾的功效，其含有的木樨草苷是重要活性成分[3]。尿血宁合剂现行的质量标准还停留在薄层扫描等定性鉴别水平，远不能适应中药质量检验检测的发展，所以，亟需建立尿血宁合剂主要活性成分定量测定的方法。研究人员以女贞子中红景天苷和墨旱莲中的木樨草苷为检测的指标性成分[4-5]，建立了对尿血宁合剂中红景天苷和木樨草苷同时进行含量测定的方法，研究如下。

1 仪器与材料

2695 型高效液相色谱仪，紫外检测器（Waters公司），US-22D型超声波清洗器（苏州市炬虹超声波设备有限公司）。

红景天苷对照品（批号：120325-201706，南京森贝伽生物科技有限公司），木樨草苷对照品（批号：101124-201708，武汉天植生物技术有限公司），乙腈（色谱纯，济南创世化工有限公司），磷酸（分析纯，济南萧试化工有限公司），甲醇（分析纯，南京维之诚化学试剂有限公司），重蒸水（本院药学实验室自制），尿血宁合剂为南京中医药大学连云港附属医院自制（批号分别为170915、171013、171116）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Athena C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），采用混合流动相，流动相A为乙腈，流动相B为0.25 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液，进行梯度洗脱，见表1；柱温25℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长275 nm，进样量10 µL。理论塔板数按照红景天苷色谱峰计算和按照木樨草苷峰计算均不低于3 500。

2.2 对照品溶液制备

取红景天苷对照品10.0 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，用体积比为20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的混合溶液溶解并定容，制成质量浓度为400 mg·L-1的对照品储备液A。另取木樨草苷对照品8 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，用体积比为20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的混合溶液溶解并定容，制成质量浓度为320 mg·L-1的对照品储备液B。分别精密量取对照品储备液A和对照品储备液B各10 mL，置于同一50 mL量瓶中，用体积比为20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的混合溶液稀释至刻度，摇匀，制得红景天苷和木樨草苷的质量浓度分别为80 mg·L-1和64 mg·L-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

精密量取尿血宁合剂5 mL，置50 mL量瓶中，加体积比为20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的混合溶液30 mL，超声处理10 min，取出，放冷，加体积比为20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的混合溶液定容至刻度，摇匀，以2500 r·min-1的速度离心10 min，上清液用0.45 µm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液制备

按尿血宁合剂的处方和制备方法，分别制备不含女贞子或墨旱莲药材的阴性样品，按“2.3”项下所述的供试品溶液的制备方法制成相应的阴性样品溶液，备用。

2.5 方法专属性考察

取对照品溶液、供试品溶液、不含女贞子的阴性样品溶液、不含墨旱莲阴性样品溶液，在“2.1”项下所述的色谱条件下各进样10 µL，分别记录色谱图，见图1。结果显示，红景天苷的保留时间为7.6 min，木樨草苷的保留时间为20.4 min，不含女贞子阴性样品溶液在红景天苷出峰区间未出现相应色谱峰，不含墨旱莲阴性样品溶液在木樨草苷出峰区间未出现相应色谱峰，实验结果表明，该方法专属性较好。

2.6 线性关系考察

分别精密吸取上述对照品储备液A、对照品储备液B各0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00 mL置于同一25 mL量瓶中，用体积比为20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的混合溶液稀释至刻度，摇匀，制成红景天苷、木樨草苷梯度浓度的混合标准溶液。精密吸取梯度浓度的混合标准溶液10µL，注入高效液相色谱仪测定。绘制标准曲线：以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，得红景天苷回归方程为Y=3.268×104X+8.267×102，r=0.999 7，红景天苷质量浓度在9～150 mg·L-1的范围内呈现良好的线性关系；木樨草苷回归方程为Y=4.158×104X-5.546×102，r=0.999 8，木樨草苷质量浓度在8～130 mg·L-1的范围内呈现良好的线性关系。

2.7 精密度试验

取同一对照品溶液，在“2.1”项下所述的色谱条件下连续进样6次，经计算，红景天苷色谱峰面积的RSD为0.95%（n=6），木樨草苷色谱峰面积的RSD为1.06%（n=6）。

2.8 方法重复性试验

取同一批号（170915）尿血宁合剂样品5份，按“2.3” 项下所述的供试品溶液的制备方法平行制备5份供试品溶液，在“2.1”项下所述的色谱条件下进行测定，红景天苷含量的相对标准偏差RSD为1.24%（n=5）；木樨草苷含量的相对标准偏差RSD为1.36%（n=5）。

图1 HPLC 色谱图

2.9 稳定性试验

吸取供试品溶液分别于0、1、2、4、8、16、24 h进样，测定峰面积，经计算，红景天苷峰面积RSD为1.16%，木樨草苷峰面积RSD为1.33%，实验结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.10 回收率试验

称取已知含量的尿血宁合剂样品（批号：170915）1.0 mL，置10 mL量瓶中，精密加入红景天苷、木樨草苷对照品溶液，按“2.3”项下所述的供试品溶液的制备方法制成低、中、高3个质量浓度的供试品溶液，按“2.1”条色谱条件下进样分析，结果见表2。

2.11 样品测定

取3批样品，每批取3份，按“2.3”项下所述的供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，在“2.1”项下所述的色谱条件下进行测定，记录色谱峰面积，按外标一点法计算红景天苷、木樨草苷的含量，结果见表3。

3 讨论

尿血宁合剂中女贞子为君药，女贞子中含有的红景天苷具有较强的药理活性，研究表明，红景天苷能抑制链尿佐菌素诱导的糖尿病肾病模型大鼠肾纤维化，对大鼠过度运动后肾损伤也具有预防保护作用。墨旱莲对肾脏也具有较强保护作用，研究表明，墨旱莲提取物能有效改善STZ诱导糖尿病大鼠的相关生化指标，并对肾脏具有保护作用，木樨草苷是墨旱莲中含有的重要活性成分，所以，对尿血宁合剂中的木樨草苷和红景天苷进行含量测定，能够反映出制剂的质量，对于提高制剂的质量标准，具有重要的意义。

为同时测定木樨草苷和红景天苷的含量，参考相关文献[6-8]，试用体积比为20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的混合溶液、体积比为20：80的甲醇-0.25 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的混合溶液、体积比为50：50的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的混合溶液等流动相系统，经过试验，以体积比为20：80的乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的混合溶液为流动相，红景天苷与木樨草苷与其他组分均能达到基线分离。

文献报道，红景天苷的最大吸收波长为224 nm、275 nm[9-10]，木樨草苷的最大吸收波长为330 nm、350 nm[11-12]；本研究分别对红景天苷和木樨草苷进行紫外扫描，结果表明，红景天苷在275 nm处有最大吸收，木樨草苷在275 nm、330 nm处有最大吸收，因红景天苷在330 nm处紫外吸收极低，故选择二者的共同最大吸收波长275 nm作为测定波长。

本研究还比较了0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1三个流速，分别对20℃、25℃、30℃ 三个柱温时，红景天苷和木樨草苷的分离度进行比较，最后确定在流速为1.0 mL·min-1、柱温为25℃，以乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液作为流动相进行梯度洗脱，能够达到比较满意的分离效果。