刘 宁,郭 芳,黄 硕

(西安医学院口腔医学院口腔颌面外科学教研室,西安 710021;*通讯作者,E-mail:ningliu@xiyi.edu.cn)

牙齿拔除后牙槽嵴的吸收改建及上颌窦气化现象的存在,常导致患者牙槽嵴宽度、高度不足,限制种植体的植入。促进骨再生的方法包括自体骨移植、异体骨移植及以细胞为基础的骨组织工程技术。自体骨移植是骨组织缺损修复的金标准,然而口腔内种植区可利用的自体骨量有限,异位取骨又伴随多种并发症,因此骨组织工程技术具有广阔的应用前景。淫羊藿苷(icariin,ICA)是从淫羊藿中提取出来的一种黄酮类化合物,是淫羊藿的主要有效成分之一,对于骨损伤修复治疗具有较好的促进疗效,可作为一种骨诱导活性因子用于骨组织的修复再生[1-3]。已有研究报道,ICA可通过ERK和p38MAPK信号通路促进骨髓间充质干细胞增殖[4],并通过ERα-Wnt/β-连环蛋白信号通路促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化[5]。骨组织工程领域中脂肪干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)具有体内存在范围广、容易获取且创伤小的优点被广泛研究和应用[6-8]。本研究拟探讨ICA对ADSCs成骨分化的作用,为其在骨再生领域的应用提供实验室依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

2周龄雄性C57BL/6J小鼠4只,由空军军医大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂和仪器

淫羊藿苷(源叶生物科技有限公司,中国),α-MEM培养基、胎牛血清、PBS缓冲液(Hyclone公司,美国),Trizol、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、FastStart Universal SYBR Green Master(Roche公司,瑞士),基因引物(Life technology公司,中国),OCN抗体、荧光二抗(Abcam公司,英国)。倒置相差显微镜及照相系统(SONY公司,日本),PCR扩增仪(Bio-Rad公司,美国),实时荧光定量PCR基因扩增仪(Roche公司,瑞士)。

1.3 脂肪干细胞的分离、培养及形态学观察

2周龄雄性C57BL/6J小鼠4只过量戊巴比妥钠麻醉处死,无菌取双侧腹股沟脂肪组织,置于培养皿中,清除外包膜及肉眼可见的小血管,PBS清洗后剪碎成约为1 mm3组织块,加入0.075%的胶原酶37 ℃振荡消化60 min。待消化完成后,1 000 r/min离心5 min。弃上清,向离心管内加入2 ml含10%胎牛血清的α-MEM培养液,1 000 r/min离心5 min。加入5 ml培养液重悬,将悬液接种于25 cm2培养瓶内,置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养。培养3 d换液,显微镜下观察细胞形态。细胞融合度达到80%时传代,将细胞培养至第3代,进行后续实验。

1.4 成骨诱导及成脂诱导

取第3代ADSCs,消化后以1×105个/孔的密度接种于6孔板中培养。当细胞达到60%-70%融合度时,向6孔板中加入2 ml脂肪间质干细胞成骨诱导分化培养液,成骨诱导21 d。当细胞达到100%融合时,吸弃培养液,向孔板中加入2 ml成脂诱导分化培养液,成脂诱导18 d。4%多聚甲醛溶液固定30 min,PBS漂洗3遍。成骨诱导细胞茜素红染液常温染色15 min,成脂诱导细胞油红O染料工作液染色30 min,PBS漂洗3遍,将培养板置于显微镜下观察染色效果。

1.5 成骨相关基因检测

取第3代ADSCs,以1×105个/孔的密度接种于6孔板,含浓度为10-7mol/L ICA的培养液培养作为实验组,单纯培养液培养作为对照组,培养7 d,使用Trizol分别提取各组细胞的总RNA,按照逆转录试剂盒的操作步骤逆转录得到cDNA,并对逆转录产物进行实时荧光定量RT-PCR,检测成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的表达水平,成骨相关基因特异性引物序列见表1。反应条件:95 ℃反应30 s,1个循环;95 ℃反应5 s,60 ℃反应34 s,40个循环。以GAPDH作为内参,统计Runx2、OPN、ALP的相对表达量。

表1 成骨相关基因特异性引物序列

Table 1 The primer sequences of osteogenic-related genes

基因 上游序列(5′-3′) 下游序列(5′-3′)Runx2CCAACCCACGAATGCACTATCTAGTGAGTGGTGGCGGACATACOPNAGCAAGAAACTCTTCCAAGCAAGTGAGATTCGTCAGATTCATCCGALPGCCCTCTCCAAGACATATACCATGATCACGTCGATATCCGAPDHGACGGCCGCATCTTCTTGTGCTGCAAATGGCAGCCCTGGTGA

1.6 免疫荧光检测

取第3代ADSCs,消化后以105个/孔的密度接种于6孔板中,含浓度为10-7mol/L ICA的培养液培养作为实验组,单纯培养液培养作为对照组,培养7 d,4%多聚甲醛固定2 h。PBS漂洗3次,0.1% Triton-X100室温孵育30 min。PBS漂洗3次,5% BSA封闭液室温孵育20 min。甩去多余液体,分别加入5 μg/ml骨钙素(osteocalcin,OCN)抗体液0.2 ml,4 ℃过夜。吸弃一抗液体,PBS漂洗3次,加入驴抗兔荧光二抗,37 ℃孵育20 min。PBS漂洗3次,滴加抗荧光淬灭封片剂,盖玻片封片,激光显微镜下观察。

1.7 统计学分析

使用SPSS18.0软件进行统计学分析,计量数据以均数±标准差表示,实验结果采用两独立样本t检验进行统计分析,以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂肪干细胞形态学观察

原代细胞培养3 d,显微镜下观察ADSCs呈簇分布,大部分细胞呈纤维细胞样梭形,突起细长,部分细胞呈多边形(见图1)。

图1 ADSCs的细胞形态 (×100)Figure 1 The morphology of ADSCs (×100)

2.2 成骨诱导茜素红染色及成脂诱导油红O染色

ADSCs成骨诱导21 d,茜素红染色,显微镜下观察可见大量散在分布的红棕色矿化结节(见图2A)。ADSCs成脂诱导18 d,油红O染色,显微镜下观察可见细胞胞质内含有大量大小不等的橘红色圆形脂滴(见图2B)。

A.茜素红染色(×100) B.油红O染色(×200)图2 ADSCs成骨诱导茜素红染色和成脂诱导油红O染色Figure 2 Alizarin red staining of ADSCs osteogenesis and Oil red O staining of ADSCs lipogenic induction

2.3 成骨分化相关基因表达

实验组用含浓度为10-7mol/L ICA的培养液培养,对照组用单纯培养液培养,培养7 d。RT-PCR方法检测ICA实验组成骨相关基因Runx2、OPN、ALP的表达水平显著高于培养基对照组,差异具有统计学意义(P<0.05,见图3)。

与对照组比较,*P<0.05图3 成骨相关基因Runx2、OPN、ALP的RT-PCR检测Figure 3 Levels of Runx2, OPN and ALP in two groups by RT-PCR (*P<0.05)

2.4 OCN免疫荧光检测

实验组用含浓度为10-7mol/L ICA的培养液培养,对照组用单纯培养液培养,培养7 d，ICA实验组OCN蛋白的表达强于培养基对照组(见图4)。

图4 OCN蛋白免疫荧光表达 (×100)Figure 4 The expression of OCN protein by immunofluorescence staining (×100)

3 讨论

骨组织工程在治疗骨缺损、促进骨再生等领域具有重要的意义。Kaplan等[9]发现皮下脂肪组织具有异位成骨现象,提出“脂肪组织中具有成骨分化潜能细胞”。进一步研究发现,ADSCs具有多向分化潜能,与BMSCs相比具有更强的增殖能力,在转录水平上具有与BMSCs十分相似的基因型和表现型[10]。多项研究证实ADSCs可直接向成骨细胞分化或通过旁分泌促进骨组织再生[11-13]。因此,基于ADSCs的骨组织重建与再生技术是目前骨组织工程领域的又一研究方向,具有广阔的应用前景。

大量研究表明,ICA在抑制骨质疏松和促进间充质干细胞成骨方面发挥作用。ICA可通过促进成骨细胞成骨相关基因的表达,从而促进成骨细胞的分化和成骨作用,并且抑制破骨细胞活性,从而促进正骨平衡,对骨质疏松有预防作用[14,15]。目前,ICA对骨髓间充质干细胞的成骨作用研究较多。研究发现ICA可通过Notch信号途径、Wnt信号途径、骨形态发生蛋白2等信号途径促进骨髓间充质干细胞成骨分化,而对其他来源的间充质干细胞的研究相对较少[16]。

本研究拟探讨ICA对ADSCs的成骨分化促进作用。首先对C57BL/6J雄鼠的腹股沟脂肪组织进行分离培养,镜下观察多数细胞呈纤维细胞样梭形。多向分化潜能是干细胞的重要生物学特性之一,成骨和成脂分化是干细胞的两个基本分化方向,是目前公认的用于鉴定干细胞分化功能的方法。将培养细胞进行成骨和成脂诱导,诱导一段时间后可见细胞间出现大量的矿化结节和脂滴,表明培养细胞具备多向分化潜能。Runx2是成骨分化的核心调控基因,是骨形成过程中最早出现、最具特异性的标志基因之一,研究显示Runx2基因敲除能显著抑制小鼠的成骨细胞发育[17]。OPN为成骨细胞分泌的非胶原蛋白,ALP的检测是最常见的测量成骨活性的指标之一。实验采用RT-PCR检测成骨相关基因Runx2、OPN、ALP的表达,实验结果显示ICA刺激组各检测基因的表达均显著高于培养基对照组(P<0.05)。检测细胞内OCN蛋白含量的表达,ICA刺激组OCN蛋白的表达强于培养基对照组,进一步证实ICA可促进ADSCs的成骨分化。然而,ICA对ADSCs成骨分化的具体作用机理仍然需要进一步的研究。

综上所述,淫羊藿苷具有促进脂肪干细胞的成骨分化的作用。下一阶段将重点研究淫羊藿苷对脂肪干细胞成骨分化作用的分子机制,为其应用于临床骨再生治疗提供实验依据。