张法煌,张 瑜,袁 芳,刘伊宁,陈 艳,伊丽达娜·斯提瓦尔地,刘 玲#,李 卉

(1新疆医科大学基础医学院生物化学教研室,乌鲁木齐 830011;2新疆医科大学第一临床医学院;3新疆医科大学中心实验室;*通讯作者,E-mail:huihui922@126.com;#共同通讯作者,E-mail:liulingpine@sohu.com)

食管癌是全世界范围内常见的恶性肿瘤之一,2015年中国因恶性肿瘤死亡的病例中,食管癌约为18.8万例,其发病率呈明显的地区差异,新疆是我国食管癌的高发区之一,2014年,据新疆地区消化道恶性肿瘤发病及死亡数据分析,食管癌位居城市消化道恶性肿瘤的第四位,农村消化道恶性肿瘤发病率之首,其中尤其以哈萨克族人群的发生率和死亡率最高[1,2]。

近年来肿瘤相关研究发现,肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关[3],因此肿瘤相关基因的甲基化可能成为肿瘤早期诊断的标记物,并且对食管癌早期预防与诊断有重要的价值。

本文采用亚硫酸盐基因测序法(bisulfite sequence,BS)对食管鳞癌组织及正常组织进行甲基化检测。BS具有可定性和定量等优点,也可作为许多衍生方法的基本原理,更好地解释DNA甲基化的奥秘,是甲基化检测的金标准[4,5]。经测序后对鳞癌组织及正常组织的不同位点甲基化程度通过秩和检验进行分析,以探讨RASSF1A和Survivin启动子区CpG岛异常甲基化程度与哈萨克族食管鳞癌发生发展的关系。

1 研究内容与方法

1.1 研究对象及材料

1.1.1 研究对象 纳入标准：新疆哈萨克族食管癌患者术后常规病理结果为鳞状细胞癌；患者术前均未接受过任何放疗、化疗、中草药等抗肿瘤治疗。排除同时患有其他恶性肿瘤患者。

1.1.2 病例资料 食管癌组织标本来源于新疆医科大学附属医院2009-2011年哈萨克族食管鳞癌患者。食管鳞癌标本29份,匹配远端无癌组织29份。参照UICC制定的癌国际TNM法分为T1期1份,T2期6份,T3期9份,T4期13份。年龄在46-61岁之间。本研究已获得新疆医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准。

1.1.3 组织标本的取材及收集 ①鳞癌组织:切取髓质型、缩窄型、溃疡型等病变部位组织;如为早期病变,取材为2/3以上的病变组织,并经病理学证实为鳞状上皮组织。②远端无癌组织:手术切缘最远端,至少5 cm以上,大体形态学正常,并经病理学证实标本切缘无癌组织残留,为正常鳞状上皮组织。

收集上述不同部位的手术标本,大部分置于标记好的冻存管中,立即置于液氮内-80 ℃保存。留取一小部分做石蜡包埋、切片、HE染色、显微镜读片,以确定组织形态学改变。显微镜读片由两位病理医生分别独立完成,结果核实确定后,纳入为研究对象。

1.1.4 主要试剂 DNA提取试剂酚,氯仿(Invitrogen,美国),异戊醇(上海生工),乙二胺四乙酸Sigma,(美国),EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research,美国),引物(上海生物工程有限公司,中国)。

1.2 方法

1.2.1 DNA甲基化处理 ①应用DNA提取试剂盒提取组织DNA并纯化定量。通过经典的酚氯仿法提取组织DNA,DNA样本取1 μl,用1%琼脂糖凝胶电泳对样本进行片段质量检测,利用紫外分光光度计对浓度进行检测。②使用DNA甲基化试剂盒对样本的DNA进行重亚硫酸盐处理和纯化,将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。

1.2.2 PCR扩增 利用Primer6.0软件进行引物设计。设计4个片段的引物,该引物对甲基化目的序列实现扩增。基因的CpG岛通过在线软件Meth Primer确定。PCR反应中RASSF1A基因和survivin基因引物见表1。反应体系均为20 μl:1x HotStarTaq缓冲液,2.0 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTP,0.2 μmol/L引物,1 U DNA聚合酶和1 μl DNA模板。反应条件见表2。

表1 PCR引物序列、片段大小

Table 1 Primer sequence and fragment size of PCR

基因 位点 引物序列(5′-3′) PCR产物大小(bp)RASSF1A1 MF:GGGGAGTTTGAGTTTATTGAGTT2971 MR:CTACCCCTTAACTACCCCTTCCRASSF1A2 MF:CCCAAGCCCACTGAGGAT2422 MR:ACCACTGCCTGGGAATGGGAGAACCsurvivin1 MF:TGCCTTCAACTTACAAAC2991 MR:ATACCCTTCACCCAGATTsurvivin2 MF:TGGTTTTTGAGAAAGGGTTGT3782 MR:CCTACCTAAACCTCTCAAAATATTAAA

MF:甲基化正向引物;MR:甲基化反向引物

表2 PCR反应条件

Table 2 Conditions for PCR reaction

基因 位点预变性11个循环变性退火延伸总延伸RASSF1A195 ℃ 15 min94 ℃ 20 s58 ℃ 40 s72 ℃ 1 min72 ℃ 2 min295 ℃ 15 min94 ℃ 20 s57 ℃ 30 s72 ℃ 1 min72 ℃ 2 minsurvivin195 ℃ 15 min94 ℃ 20 s60 ℃ 40 s72 ℃ 1 min72 ℃ 2 min295 ℃ 15 min94 ℃ 20 s55 ℃ 30 s72 ℃ 1 min72 ℃ 2 min

1.2.3 PCR产物纯化 取1 U虾碱酶(SAP)和6 U外切酶Ⅰ(EXO Ⅰ)加入到8 μl PCR产物中,37 ℃孵育60 min后70 ℃孵育10 min,消化PCR扩增体系中多余的dNTPs和引物,以便后续的测序。

1.2.4 测序反应 反应体系:2 μl BigDye3.1 mix,2 μl测序引物(0.4 μmol/L),2 μl PCR纯化产物。反应参数:96 ℃预变性1 min;96 ℃变性10 s,28个循环;57 ℃退火5 s;60 ℃延伸4 min。

1.2.5 测序 测序产物上ABI3130XL测序仪进行测序。

1.3 统计分析

采用SPSS 19.0统计软件。29对样本甲基化结果用0,1,2,3,4分别代表每个CpG的甲基化程度;0为不甲基化,1为<33%,2为33%-67%,3为>67%-<99%,4为99%-100%。采用秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RASSF1A基因测序结果及比较

在29对标本中,比较了RASSF1A基因启动子区2个位点,在29个样本测序图中随机截图标注(见图1),差异无统计学意义(见表3)。

蓝色箭头所指代表CpG序列甲基化,红色箭头所指代表CpG序列未甲基化图1 RASSF1A部分样本甲基化及未甲基化位点截图Figure 1 Screenshots of methylated and unmethylated sites in part of RASSF1A samples

2.2 survivin基因测序结果及比较

在29对标本中,比较了survivin基因启动子区2个位点,在29个样本测序图中随机截图标注(见图2),有1个位点癌组织甲基化程度高于正常组织,差异有统计学意义(见表4)。

表3 RASSF1A基因29对样本2个位点甲基化程度比较(例)

Table 3 Comparison of methylation degree of RASSF1A in 29 matched samples at two sites(cases)

位点甲基化程度癌组织癌旁组织ZP位点102327-1.1550.248141221位点202522-0.6320.527126221

蓝色箭头所指代表CpG序列甲基化,红色箭头所指代表CpG序列未甲基化图2 survivin部分样本甲基化及未甲基化位点截图Figure 2 Screenshots of methylated and unmethylated sites in part of survivin samples

表4 survivin基因29对样本2个位点甲基化程度比较(例)

Table 4 Comparison of methylation degree of survivin in 29 matched samples at two sites(cases)

位点甲基化程度癌组织癌旁组织ZP位点102923-2.0000.046206位点202625-1.0000.317201

3 讨论

DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式之一,甲基化修饰主要发生于基因启动子附近的CpG岛,可通过激活或沉默肿瘤原癌基因或肿瘤抑制基因的表达从而影响其发生、发展及预后[6,7]。近些年,对基因启动子区CpG岛甲基化的研究成为表观遗传学领域的热点之一,在食管癌中,频繁发生启动子区甲基化的基因具有作为分子标志物的潜力,可能成为潜在的分子靶点[8]。

Ras相关家族(Ras association domain family gene-1A,RASSF1A)是位于人类染色体3p21.3上的抑癌基因,与食管癌的发生发展相关[9]。研究发现,RASSF1A基因启动子甲基化和肺癌、乳腺癌、膀胱癌等恶性肿瘤易感性存在紧密联系,并与预后相关,有望成为临床的早期生物标志物[10]。孟凡勇等[11]研究表明,RASSF1A基因启动子甲基化可能参与了胃癌的发生、发展过程,有可能作为胃癌分级、预后评估的新指标。在食管癌相关研究中,RASSF1A基因甲基化阳性检测率显著高于癌旁组织,且明显高于肿瘤标志物的阳性检测率,因此在食管癌中,RASSF1A基因启动子区甲基化的变化具有预警价值[12]。本实验中,在29对标本比较食管鳞癌组织与癌旁远端正常组织RASSF1A基因启动子区2个CpG岛位点甲基化程度,差异无统计学意义(P>0.05),可能与样本量及地域差异性相关。

Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的新成员,参与调控细胞重要的生理病理过程,具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和肿瘤间质血管形成等作用[13]。survivin基因含有一个大的CpG岛,从启动子区一直延伸到第一外显子区域,提示其甲基化修饰可能参与survivin基因的转录调控。在食管鳞状细胞癌组织中,有研究证实survivin的表达与否与其CpG岛的甲基化状态无关,提示该区域的甲基化修饰未参与调控survivin基因的转录[7]。我们的前期结果表明[14-17],在哈萨克族食管鳞癌癌组织中,survivin mRNA水平表达的增高对其发生、发展过程中起到了一定的作用;survivin基因在36对癌组织及正常组织中,癌组织表达占69%,明显高于正常组织,癌组织和正常组织启动子区多为部分甲基化状态,提示哈萨克族食管鳞癌中survivin基因启动子区的甲基化状态可能是其高表达原因之一,并且已成功构建survivin基因启动子区CpG岛真核表达载体,以探讨其甲基化在哈萨克族食管癌中的作用。本实验中,在29对标本中比较食管鳞癌组织与正常组织survivin基因启动子区2个CpG岛位点甲基化程度,有1个位点癌组织甲基化程度高于正常组织,差异有统计学意义(P=0.046)。

综上所述,哈萨克族食管鳞癌患者癌组织中RASSF1A和survivin启动子区甲基化程度与正常组织比较,RASSF1A甲基化程度未见明显差异,Survivin甲基化程度高于正常组织,提示哈萨克族食管鳞癌的发生与RASSF1A基因启动子区甲基化程度可能不直接相关,而survivin基因启动子区异常甲基化可能与其发生有关,两者在哈萨克族食管鳞癌的发生发展中作用与其在其他民族中的作用可能有所不同,具体机制仍需扩大样品量和方法进一步研究。