张 军,吴一凡,张茂娜,江 悦,江 忍,张 弘*

(1湖北省鄂州市中心医院病理科,鄂州 436000;2三峡大学医学院形态学教研室;*通讯作者,E-mail:zmn0306@126.com)

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,具有较强的增殖和迁移能力,患者通常预后较差[1]。肝癌发生、发展的分子机制尚未明确,寻求调控肝癌发病的分子标志物对抑制肝癌的恶性生物学行为具有重要的临床意义。长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA,参与调控基因表达,影响疾病特别是肿瘤的发生、发展[2]。越来越多的lncRNA被报道在肝癌的恶性生物学行为中发挥关键作用,并与肝癌患者的预后有关[3,4]。CTC-459F4.3是一种新确定的lncRNA,其在肝癌中的表达及作用机制尚不明确。本研究通过检测CTC-459F4.3在肝癌组织和细胞株中的表达并构建携带CTC-459F4.3的质粒,旨在探讨过表达CTC-459F4.3对肝癌细胞增殖和迁移的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 组织标本及细胞株

收集2017-04～2018-08武汉大学人民医院鄂州医院普外科肝癌手术切除标本28例。所有组织标本经术后病理科医生证实。所有患者均未行术前放疗和化疗。本研究经本院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。肝癌细胞株(Huh7、SMMC-7721、MHCC-97H和BEL-7404)以及人正常肝细胞(LO2)购自中国典型培养物保藏中心。

1.2 主要试剂

DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。携带无意义序列的阴性对照质粒和携带CTC-459F4.3的质粒购自广州锐博生物科技有限公司。qPCR引物购自上海生物工程股份有限公司。qPCR试剂盒购于日本TaKaRa公司。LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购自美国Sigma公司。Transwell小室购自美国corning公司。GAPDH、Rb、p-Rb、CTDSPL、PCNA、MCM7、E2F1蛋白抗体购自英国Abcam公司(蛋白编号分别为ab8245、ab181616、ab47763、ab36839、ab92552、ab2360和ab218527)。

1.3 细胞培养和转染

在37 ℃、5% CO2培养箱中,肝癌细胞株(Huh7、SMMC-7721、MHCC-97H和BEL-7404)以及正常肝细胞(LO2)均采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。以对数生长期的SMMC-7721细胞为转染对象,根据LipofectamineTM3000说明书转染。细胞随机分为阴性对照组(转染携带无意义序列的阴性质粒)和CTC-459F4.3组(转染携带CTC-459F4.3的质粒)。转染后细胞常规培养48 h,进行后续实验。

1.4 qPCR检测组织或细胞中CTC-459F4.3和CTDSPL mRNA的表达

组织或细胞总RNA采用Trizol法提取,检测RNA纯度,并将吸光度为1.8-2.0的RNA逆转录为cDNA。组织或细胞中CTC-459F4.3和CTDSPL mRNA的表达采用qPCR试剂盒检测,反应条件为96 ℃ 5 min、95 ℃ 5 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,38个循环,GAPDH为内参。以2-ΔΔCt方法计算CTC-459F4.3和CTDSPL mRNA在肝癌组织或细胞中的表达量。qPCR引物见表1。

表1 检测CTC-459F4.3和CTDSPL mRNA表达的qPCR引物序列

Table 1 The qPCR primer sequences for detecting CTC-459F4.3 and CTDSPL mRNA expression

基因 序列(5′-3′) CTC-459F4.3上游:GGGCATGCTGGTAATAGTGTC下游:TGCTGAGACTGTAGTCCCATAGCCTDSPL上游:CCACCAGCTAAGTACCTTCTTCC下游:GGCCGCTTCAGCACATACAGAPDH上游:CTGTGGGAGCGAATCGAGG下游:CAGCGCAAGATGTCCATCA

1.5 MTT法检测SMMC-7721细胞增殖

取对数生长期的SMMC-7721细胞制备单细胞悬液,按3×103个/孔接种到96孔板,每孔250 μl,每组4个复孔。检测时,加15 μl/孔MTT溶液,培养4 h,弃上清,加200 μl/孔二甲基亚砜,摇床振荡18 min,酶标仪测定波长(460 nm)下每孔的吸光值,每24 h检测1次,连续5次。

1.6 Transwell迁移实验检测SMMC-7721细胞迁移

取对数生长期的SMMC-7721细胞使用无血清培养基制备单细胞悬液,按3×104个/孔接种到Trans-well小室的上室,每孔250 μl,下室加550 μl含10%血清的培养基,每组4个复孔。培养箱连续培养24 h。取出上室,甲醛固定30 min,0.1%结晶紫染液染色30 min,棉签轻轻擦去上室侧未穿膜的细胞。选取4个高倍视野,计数穿过上室面的细胞数并取均值统计分析。

1.7 免疫组化检测肝癌组织中CTDSPL蛋白的表达

肝癌组织及癌旁组织进行石蜡切片，脱蜡及水化后，使用过氧化氢(体积分数0.3%)孵育15 min。使用PBS溶液浸泡15 min，使用血清工作液在室温下孵育20 min。使用一抗CTDSPL稀释液(1 ∶100稀释)在4 ℃下孵育过夜。37 ℃复温60 min，PBS溶液清洗。使用二抗室温下孵育60 min，PBS溶液清洗。使用DAB溶液显色5 min，使用苏木精复染后，盐酸乙醇分化并封片。在显微镜下观察肝癌组织及癌旁组织中CTDSPL蛋白的表达。CTDSPL蛋白阳性反应为细胞质中出现棕色颗粒。

1.8 Western blot检测细胞CTDSPL及下游蛋白的表达

裂解对数生长期的SMMC-7721细胞并提取蛋白,BCA法检测各组蛋白样品浓度,以40 μg上样量计算各组上样体积。灌制10%聚丙烯酰氨凝胶,恒压110 V电泳分离蛋白样品,硝酸纤维膜转膜,使用5%脱脂奶粉封闭,分别与一抗GAPDH(1 ∶2 000)、Rb(1 ∶2 000)、p-Rb(1 ∶1 000)、CTDSPL(1 ∶1 000)、PCNA(1 ∶1 000)、MCM7(1 ∶1 000)和E2F1(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育过夜,分别与二抗在室温下孵育,迅速采用ECL化学发光试剂发光,凝胶成像系统扫描胶片。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 CTC-459F4.3在肝癌组织和癌旁组织中的表达

与癌旁组织相比,CTC-459F4.3在肝癌组织中呈低表达(P<0.01,见图1)。

与癌旁组织相比,**P<0.01图1 CTC-459F4.3在肝癌组织和癌旁组织中的表达Figure 1 Expression of CTC-459F4.3 in hepatic carcinoma tissues and adjacent tissues

2.2 CTC-459F4.3在正常肝细胞和肝癌细胞株的表达

与正常肝细胞(LO2)相比,肝癌细胞株(Huh7、SMMC-7721、MHCC-97H和BEL-7404)中CTC-459F4.3均呈低表达(P<0.05),SMMC-7721细胞中CTC-459F4.3的表达最低(P<0.01,见图2)。

2.3 CTC-459F4.3质粒的转染效率

阴性对照组和CTC-459F4.3组SMMC-7721细胞中CTC-459F4.3相对表达量分别为1.08±0.27和11.20±1.07(t=9.15,P<0.01),质粒转染成功。

与LO2细胞相比,*P<0.05,**P<0.01图2 CTC-459F4.3在正常肝细胞和肝癌细胞株中的表达Figure 2 Expression of CTC-459F4.3 in human normal liver cells and hepatic carcinoma cell lines

2.4 过表达CTC-459F4.3对SMMC-7721细胞增殖的影响

MTT检测结果显示,与阴性对照组相比,CTC-459F4.3组的SMMC-7721细胞从第3天开始,增殖能力明显降低(P<0.05,见图3)。

与阴性对照组相比,*P<0.05,**P<0.01图3 CTC-459F4.3对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响Figure 3 Effect of CTC-459F4.3 on proliferation of hepatic carcinoma cells SMMC-7721

2.5 过表达CTC-459F4.3对SMMC-7721细胞迁移的影响

阴性对照组和CTC-459F4.3组SMMC-7721细胞迁移细胞计数分别为124.10±19.16和56.06±8.82(P<0.05)。与阴性对照组相比,转染CTC-459F4.3后的肝癌细胞迁移能力被明显抑制(见图4)。

2.6 CTDSPL蛋白在肝癌组织和癌旁组织中的表达

免疫组化法检测肝癌组织和癌旁组织中CTDSPL蛋白的表达,CTDSPL阳性结果表现为细胞质棕黄色颗粒(见图5)。肝癌组织和癌旁组织中CTDSPL蛋白的相对表达量分别为4.20±0.47和0.49±0.14(t=7.54,P<0.01),与癌旁组织相比,CTDSPL在肝癌组织中的表达明显减少。

与阴性对照组相比,*P<0.05图4 CTC-459F4.3对肝癌细胞SMMC-7721迁移的影响Figure 4 Effect of CTC-459F4.3 on migration of hepatic carcinoma cells SMMC-7721

2.7 两组细胞中CTDSPL mRNA的表达

阴性对照组和CTC-459F4.3组SMMC-7721细胞中CTDSPL mRNA相对表达量分别为1.08±0.25和5.53±0.56(t=7.28,P<0.01)。与阴性对照组相比,CTC-459F4.3组细胞中CTDSPL mRNA的表达明显增加。

2.8 过表达CTC-459F4.3对CTDSPL蛋白及下游蛋白表达的影响

Western blotting结果显示,与阴性对照组相比,转染CTC-459F4.3后,CTDSPL蛋白表达明显增加,Rb蛋白的磷酸化水平降低,PCNA、MCM7、E2F1蛋白的表达明显降低(见图6)。

图5 肝癌组织和癌旁组织中CTDSPL蛋白的表达Figure 5 Expression of CTDSPL protein in hepatic carcinoma tissues and adjacent tissues

图6 Western blotting检测CTC-459F4.3对CTDSPL及下游蛋白表达的影响Figure 6 The effect of CTC-459F4.3 on the CTDSPL protein and downstream target protein expression by Western blotting

3 讨论

肝癌的治疗主要是手术治疗,然而大多数肝癌确诊即为晚期,针对晚期肝癌尚无有效的治疗方法[5]。探索肝癌发生、发展中的分子调控机制,对肝癌靶向药物研发具有重要临床意义。近年的研究表明,长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)在表观遗传学、转录、转录后及表观遗传学调控基因的表达,已成为肿瘤发生、发展分子作用机制研究的重点[6]。肝癌细胞的增殖和迁移行为受细胞内基因组学的调控,lncRNA发挥着重要调控作用[7]。SNHG6、GHET1、RGMB-AS1、ANRIL、XIST、TSLNC8等[8-13]lncRNA被发现参与肝癌的发生、发展,且与肝癌的临床分期、分级及预后相关,lncRNA在肝癌发病过程中的重要作用受到越来越多的关注。CTC-459F4.3是一种新发现的lncRNA,其在肿瘤特别是肝癌中的作用尚不清楚。

本研究结果显示,CTC-459F4.3在肝癌组织和细胞株中呈低表达,CTC-459F4.3可能参与抑制肝癌的发生、发展。MTT法和Transwell迁移实验表明,过表达CTC-459F4.3可抑制肝癌细胞的增殖和迁移。CTDSPL全称羧基末端区域小磷酸化酶样蛋白,定位于染色体3p21.3区域[14]。CTDSPL作为一种抑癌基因,在葡萄膜黑色素瘤、非小细胞肺癌等多种肿瘤中表达明显降低[15]。本研究通过免疫组化实验显示,肝癌组织中CTDSPL蛋白的表达显著降低。过表达CTC-459F4.3的SMMC-7721细胞中CTDSPL表达明显增加,表明CTC-459F4.3可促进CTDSPL蛋白的表达。视网膜母细胞瘤基因(Rb基因)的下游基因PCNA、MCM7对肿瘤细胞的增殖过程至关重要,E2F1蛋白可促进肿瘤细胞的转移[16-18]。CTDSPL可抑制Rb蛋白的磷酸化,而Rb的去磷酸化具有下调PCNA、MCM7、E2F1蛋白表达的作用,发挥抑制肿瘤生长和转移的作用[14-18]。本研究结果表明,CTC-459F4.3促进CTDSPL表达上调后,Rb蛋白的磷酸化水平降低,PCNA、MCM7、E2F1蛋白的表达明显降低,表明肝癌SMMC-7721细胞的增殖和迁移能力可能降低。lncRNA CTC-459F4.3调控CTDSPL基因表达的具体分子机制尚不清楚,这是本课题组下一步研究的重点。

综上所述,lncRNA CTC-459F4.3在肝癌组织和细胞株中呈低表达,过表达CTC-459F4.3可通过上调CTDSPL基因的表达并促进Rb蛋白的去磷酸化,抑制肝癌细胞的增殖和迁移,CTC-459F4.3有望成为肝癌的治疗靶点和分子诊断标志物。