叶 芸,李苏亮,郝晓柯

(1西安医学院第一附属医院输血科,西安 710077;2空军军医大学西京医院检验科;*通讯作者,E-mail:haoxkg@fmmu.edu.cn)

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性泌尿系统较常见的恶性肿瘤之一,发病率在欧美人群中居首位,死亡率仅次于肺癌[1]。随着我国人口老龄化及饮食结构的改变,前列腺癌的发病率逐渐增加。miRNA是一类19-24 nt左右的非编码RNA,可与靶mRNA3′UTR结合并调控基因表达,导致靶基因异常[2,3]。miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展存在关联[4],有关循环miRNA和前列腺癌之间关系的研究已经有很多报道,包括多种miRNAs如375、34a、141、let-7a等[5,6]。Bryant等[7]和Selth等[8]分别通过临床试验和动物实验证实转移性PCa与miR-141水平相关,转移性PCa的miR-141水平高于未转移者。然而,关于miR-141对于前列腺癌骨转移发生发展的作用及确切调控机制等问题尚需进一步研究明确。本文旨在探讨miR-141-3p与DLC1在调控前列腺癌骨转移发生发展过程中的作用,为前列腺癌骨转移的诊断及治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验对象 ①细胞株:人前列腺癌细胞MDA PCa 2b和人前列腺上皮细胞RWPE-1购自美国模式菌种收集中心ATCC(Manassas, VA, USA)。②实验动物:6周龄Balb/c裸鼠购自空军军医大学动物实验中心。③血清样本:收集2013-01～2018-08于我院病理确诊的前列腺癌骨转移患者,局限性前列腺癌患者及年龄匹配的门诊体检健康男性血清样本(清晨空腹静脉血3 ml),每组各20例。本研究已通过西安医学院第一附属医院伦理委员会审核(批号:XYFY-0131)。

1.1.2 主要试剂与仪器 F12K细胞培养基(Gibco BRL Co. Ltd.,USA);青霉素100 U/ml和链霉素100 U/ml(HyClone,Logan,UT,USA);胎牛血清(Gibco BRL Co.Ltd.,USA);mirVana miRNA分离试剂盒(Ambion公司);M-MLV逆转录试剂盒(Takara公司);Trizol试剂盒(Invitrogen公司);TRAP染色试剂盒(Sigma公司);ALP染色试剂盒(Solarbio公司);HE染色试剂盒及Masson染色试剂盒(北京索莱宝生物科技公司);鼠抗兔多克隆DLC1抗体、鼠抗兔多克隆Cdc42抗体、鼠抗兔多克隆p38抗体、鼠抗兔多克隆OPG抗体(Abcam公司);赛默飞世尔CO2培养箱(Thermo Fisher公司);美国ABI 7500 PCR仪(美国ABI公司);Siemens Inveon Micro-CT(德国Siemens公司);小动物气体麻醉机(美国harvard公司);RM2245石蜡切片机(德国Leica公司);Illumina HiSeqTM 2500测序仪(Illumina公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 MDA PCa 2b和RWPE-1细胞使用含有L-谷氨酰胺的F12K细胞培养基,10%胎牛血清的细胞培养基中,置于37 ℃ 5%CO2环境的培养箱中。

1.2.2 miR-141-3p与DLC1之间靶向关系预测 应用miRGator 3.0软件及TargetScan Human 7.1,对miR-141-3p与DLC1之间靶向关系进行预测。

1.2.3 样本中总RNA的提取及real-time PCR Trizol法提取细胞中RNA,检测RNA纯度。根据反转录试剂盒(Takara)操作说明进行逆转录,将所得的cDNA加入75 μl ddH2O稀释用作real-time PCR模板,real-time PCR的程序设置:94 ℃进行预变性2 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min,共40个循环。在ABI 7500(Applied Biosystems)PCR仪上进行操作,使用2-ΔΔCt法计算miRNA相对表达量,qRT-PCR引物购自上海生工生物科技有限公司,引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

基因序列 DLC1F:TGGACAACGACCGAACCACADLC1R:CCATCTCAGTCGGTGCCTGTGAPDHF:GGGTGTGAACCATGAGAAGTGAPDHR:GACTGTGGTCATGAGTCCTmiR-141-3pRT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC GCACTGGATACGACCCATCTTTmiR-141-3pF:ATGGTTCGTGCGTAACACTGTCTGGTAAAU6 HoMsRnF:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAATU6 HoMsRnR:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT通用HoMsRnR:GCAGGGTCCGAGGTATTC

1.2.4 构建cDNA文库 凝胶电泳进行miRNA分离纯化,然后逆转录进行cDNA的合成,分别在3′端与5′端进行接头连接,最后PCR扩增,获取miRNA的测序文库。根据Illumina Hi SeqTM 2500测序仪的标准进行操作,将cDNA文库上机测试。该部分实验是由广州锐博生物公司检测完成。

1.2.5 生物信息学分析 通过对样本进行测序所得50 nt原始序列集(raw reads)初步过滤,获得干净序列(clean reads),统计计算序列长度的分布和样本的共有序列。将clean reads进行分类和注释,得到样品中各种sRNA(小分子RNA)的成分和表达信息。去除miRNA外的非编码RNA的序列后,和miRBase 21.0数据库已知人类的miRNA序列进行了比较。当所有的小RNA片段均被注释后,用校正公式进行miRNA表达值的计算。使用散点图和log2Ratio进行比较共表达miRNA的表达量。| log2(Fold Change)|=log2(样品2 RPM值/样品1 RPM值)绝对值。利用edger分析对每个组中miRNA差异的显著性进行分析并计算P值,以此为基础计算-log10P值并筛选差异表达的miRNA。

1.2.6 双荧光素酶报告实验 采用PCR的方法,按照DLC1(human) 3′UTR的序列信息来设计扩增引物,293T基因组DNA作为模板扩增其DLC1 3′ UTR的序列并克隆至pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶的报告载体之中,载体报告荧光是hRluc,校正荧光是hluc。以野生型载体为基础,利用PCR的方法设计突变引物构建突变载体,将靶序列CAGTGTTA突变成为GTCACAAT(mut1),CAGTGTT突变成为GTCACAA(mut2)。37 ℃ 5% CO2的常规条件下培养293T细胞,将293T细胞1.5×104/孔的浓度接种至96孔板,每孔的体积为100 μl,37 ℃培养24 h。按照LipofectamineTM2000转染步骤将野生型及突变型报告质粒分别与mimics(内源性成熟miRNA功能活性增强剂)及mimics NC(阴性对照)共转,转染结束后,使用荧光照度计进行荧光值的测定。

1.2.7 转染实验 miR-141-3p mimics,阴性对照寡核苷酸(miR-NC),miR-141-3p inhibitor,阴性对照寡核苷酸(anti-miR-NC)购自Ribo Bio公司(中国广州)。按照Lipofectamine2000转染步骤进行,转染效率通过荧光显微镜计算荧光素标记细胞的百分比。

1.2.8 前列腺癌骨转移动物模型构建 6周龄雄性Balb/c裸鼠分为两组,分别尾静脉注射转染miR-141-3p mimics的前列腺癌骨转移细胞MDA PCa 2b和未转染MDA PCa 2b,每周3次,每次100 μg/只;注射3周后,两组动物分别在右侧股骨和胫骨骨内注射2.0×106转染miR-141-3p mimics的MDA PCa 2b细胞和未转染的MDA PCa 2b细胞,利用micro-CT观察动物成瘤情况。

1.3 统计学分析

应用SPSS 18.0软件(SPSS Inc.,Chicago, IL, USA)进行统计学分析。采用Mann-WhitneyU检验分析非参数数据;采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey检验对参数数据进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-141-3p在血清中的差异表达

RT-PCR检测前列腺癌骨转移患者、局限性前列腺癌患者、健康人血清中miR-141-3p的表达水平,结果显示,前列腺癌骨转移患者血清miR-141-3p的表达水平显著升高(见图1)。

与健康对照比较，*P<0.05，**P<0.01;与局限性前列腺癌比较，##P<0.01图1 前列腺癌骨转移患者、局限性前列腺癌患者、健康人血清miR-141-3p的表达水平Figure 1 Serum levels of miR-141-3p in prostate cancer patients with bone metastasis, patients with localized prostate cancer and normal controls

2.2 细胞培养液miRNAs差异表达分析

前列腺癌骨转移细胞株MDA PCA 2b与前列腺正常上皮细胞RWPE-1差异表达的50个miRNA聚类分析能完全区分两株细胞(见图2)。前列腺癌骨转移细胞株MDA PCA 2b表达上调的前3名分别是miR-375,miR-200c-3p和miR-141-3p;表达下调前3名分别是miR-100-5p,miR-584-5p和miR-125b-1-3p(见图3)。

2.3 miR-141-3p靶基因预测

采用miRGator V3.0数据库对miR-141-3p的靶基因及作用位点进行预测分析,结果显示DLC1为miR-141-3p可能作用的靶分子(见图4)。

蓝色从浅到深变化意味表达量越低;红色从浅到深变化意味表达量越高图2 miRNA表达差异的热图Figure 2 Heatmap of miRNA differential expression

图3 miRNA表达差异的火山图Figure 3 Volcano plot of miRNA differential expression

图4 miR-141-3pp的靶基因及作用位点预测Figure 4 Prediction of the miR-141-3p target gene

2.4 miR-141-3p靶基因验证

靶基因验证结果显示，hsa-miR-141-3p mimic显著下调DLC1野生型报告荧光,利用突变载体mut1将预测靶位点突变后其突变载体的报告荧光值升高;而利用突变载体mut2将预测靶位点突变后其突变载体的报告荧光值仍旧明显下调,结果显示hsa-miR-141-3p很可能通过突变载体mut1所突变的位点来调控靶基因的表达(见图5)。为了进一步证实miR-141-3p对DLC1的靶向负调控作用,我们用miR-141-3p mimics和inhibitor转染成骨细胞,结果显示随着miR-141-3p水平的升高,DLC1在蛋白水平及mRNA水平表达显著下降(P<0.01,见图6)。

2.5 前列腺癌骨转移动物模型构建

2个月后,转染组的右腿股骨和胫骨处出现明显骨转移瘤,未转染组未见明显转移瘤(见图7)。

2.6 两组裸鼠骨组织的病理染色结果

对两组裸鼠的骨组织进行病理染色分析,HE染色发现转染组骨转移瘤病理表现为绝大部分成骨性改变成骨细胞增殖,肿瘤间质组织减少,骨小梁结构破坏,肿瘤细胞排列紧密,极性消失,核浆比例失调,病理性核分裂相多见;未转染组骨小梁结构完整,可见较为明显的骨髓腔结构,未见肿瘤细胞。ALP染色发现本实验中转染组可见大量ALP染色呈棕色的成骨细胞增殖;未转染组ALP染色阳性细胞数量较少,且阳性程度较弱。Masson染色显示转染组骨组织成熟程度明显增强。TRAP染色结果显示转染组破骨细胞分布较另外两组明显减少(见图8)。免疫组化染色显示转染组骨组织中DLC1阴性表达,Cdc42、p38及OPG呈强阳性表达;未转染组骨组织中DLC1呈阳性表达(见图9)。

与DLC1-Mut1+NC比较,**P<0.01图5 miR-141-3p靶基因验证Figure 5 Identification of the miR-141-3p target gene

与mimics比较，**P<0.01图6 miR-141-3p表达与DLC1的相关性Figure 6 The correlation between miR-141-3p expression and DLC1

A.转染组可见大量云雾状骨密度增高性阴影,呈成骨性改变;B.未转染组未见明显骨密度增高性阴影图7 动物模型构建Figure 7 Mouse xenograft model establishment

图8 两组裸鼠骨组织的病理染色结果Figure 8 The pathological staining of bone tissues in two groups

免疫组化染色结果以细胞核内出现棕褐色或棕褐色颗粒为阳性结果图9 两组裸鼠的骨组织免疫组化染色结果Figure 9 The results of immunohistochemical staining of bone tissues in two groups

3 讨论

前列腺癌在全世界范围内已成为备受关注的公共健康问题。据统计,全球新发前列腺癌患者占新发癌症患者总数的11.7%。miR-141属于miR-200家族,位于人类的12号染色体(12p13.31),而肿瘤组织中经常出现该区域的点突变、易位及染色体缺失。miRNA-141的前体可以在细胞浆中经过剪切和加工产生miR-141-3p和miR-141-5p两个成熟产物[9]。

Volinia等[10]在前列腺癌的研究中分析了56例肿瘤组织和7例非肿瘤组织,结果表明在前列腺癌中有39个miRNA上调,6个miRNA下调。Mitchell等[11]分析了50个人的血清标本,发现miR-141,miR-125b,miR-143和miR-296在转移性前列腺癌组的血清中高表达,其中miR-141的差异最为显著,其表达上调46倍。大量研究证实miRNA在前列腺癌发生及发展中表达失调,且前列腺癌患者与正常人群之间存在差异表达[12,13]。另有研究发现异常表达的exosomal miR-141-3p与前列腺癌骨转移的发生有关[14,15]。在本研究中我们发现前列腺癌miR-141-3p的表达水平显著升高且与转移密切相关。本研究识别了前列腺癌骨转移细胞株MDA PCA 2b与前列腺正常上皮细胞RWPE-1差异表达的50个miRNA聚类分析能完全区分两株细胞。前列腺癌骨转移细胞株MDA PCA 2b的exosomes表达上调的前3名分别是miR-375,miR-200c-3p和miR-141-3p;表达下调前3名分别是miR-100-5p,miR-584-5p和miR-125b-1-3p。

本研究中,靶基因验证结果显示hsa-miR-141-3p mimic显著下调DLC1野生型报告荧光,且很可能是通过mut1所突变的位点来调控靶基因的表达。miR-141-3p mimics/inhibitor转染成骨细胞,结果显示随着miR-141-3p水平的升高,DLC1在蛋白水平及mRNA水平表达显著下降,进一步证实miR-141-3p对DLC1的靶向负调控作用。

前列腺癌骨转移主要表现为成骨性骨转移,其影像学表现呈棉团状、牙质样、磨玻璃状的密度增高影。前列腺癌细胞与成骨/破骨细胞之间相互作用,打破正常的成骨/破骨细胞动态平衡最终发生成骨性骨转移[16]。p38MAPK作为细胞内的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其信号转导途径是细胞外信号引起核内反应的重要通道,可被多种刺激因子激活,通过影响基因的转录和调控改变细胞的生物学行为[17]。研究发现p38MAPK在成骨细胞的增殖、分化、凋亡过程中起着重要的调控作用[18]。成骨分化相关基因OPG变化在调节成骨/破骨细胞之间的平衡中起到重要的作用[19]。

本研究利用动物实验证明miR-141-3p显著促进前列腺癌骨转移,通过micro-CT、病理染色进一步证实miR-141-3p靶向抑制DLC1的表达进而激活Cdc42和P38 MAPK的磷酸化,从而使P38 MAPK信号通路激活,促进成骨活性基因表达,升高OPG表达,为前列腺癌成骨性骨转移微环境的形成奠定了基础。充分证实miR-141-3p在前列腺癌骨定向侵袭、骨转移灶形成等过程中发挥重要作用。