康林芝，熊荣园，金磊，唐惠妍

（1.韶关学院英东食品科学与工程学院，广东韶关512005；2.南充职业技术学院，四川南充637000；3.广州白云山和记黄埔中药有限公司，广东广州510640）

原生质体融合技术无细胞壁障碍，细胞融合频率高，从而使基因重组的频率也高，具有许多常规杂交所不具有的优势。细胞融合技术是改进品种风味和创造新品种的有效方法之一，近年来，该技术被广泛应用于食用菌育种和基础研究并取得了可喜的成绩，在我国、日本和西欧的研究进展较快[1-2]。至今为止，国内外学者已从杏鲍菇Pleurotus eryngii、香菇Lentinus edodes （Berk.）Pegler、 金 针 菇 Flammulina velutipes（Curt.）Singer、平菇 Pleurotus ostreatus、草菇 Volvariella volvacea（Bull.）Singer、灵芝 Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst 等多种食用菌中成功制备原生质体，在食用菌育种方向进行了大量的研究，取得了令人瞩目的进展[3-5]。而且融合杂交既可发生在种内，也可发生在种间和属间，对于参与融合的亲本株，可以不需要特殊的遗传标记或精确的遗传分析，这对生产实践中食用菌新品种选育和食用菌遗传学的基础研究具有十分重要的意义。

平菇含丰富的营养物质，每百克干品含蛋白质20 g～23 g，而且氨基酸成分种类齐全，矿物质含量十分丰富。中温型平菇子实体分化最适宜的温度范围20 ℃～24 ℃，菌丝体在3 ℃仍可以生长。金针菇菌盖滑嫩、菌柄细长脆嫩，形美，味鲜，蛋白质含量高，氨基酸种类丰富，并含有多种维生素和各种微量元素，还含有抗癌和提高免疫功能的活性物质，是一种深受人们喜爱的食药用菌。因此，金针菇既是一种美味食品，又是较好的保健食品，具有相当广阔的开发前景。但是金针菇属于低温结实型的食用菌，生长环境内的低温气候条件，是影响其产量和品质的关键因素。金针菇菌丝体在温度高于34 ℃则停止生长，甚至死亡；子实体发育适宜温度为8 ℃～13 ℃，如果温度高于20 ℃则无法正常形成原基或子实体，甚至无原基形成。智能化工厂栽培金针菇，整个生育期内需要制冷设备制冷控温，能源消耗大，培育成本高。为了解决这些突出矛盾，创造丰富多样的金针菇种质资源、节约能源消耗和降低生产成本，选育适用于反季节人工栽培和节能型工厂化生产高温型金针菇优良品种就显得尤为重要。

本研究选取耐低温、代谢能力强的白色金针菇与高产量白色平菇进行远缘亲本的原生质体融合，试图在远缘亲本原生质体融合及融合子鉴定等方面做一些探讨，为食用菌在细胞水平上的杂交育种提供参考。

1 材料

1.1 供试菌株

金针菇（F1）和平菇（P8）菌种是韶关学院微生物研究室-80 ℃保存的2 株商品化栽培品种。

1.2 培养基配制

液体PDA 培养基：马铃薯去皮后称取200 g，加水500 mL，煮沸 10 min～20 min，3 层纱布过滤，取滤液备用。向滤液中加入20 g 葡萄糖，3 g 磷酸二氢钾，1.5 g硫酸镁充分溶解后加水至1 000 mL，pH 5.5～6.0，分装于各锥形瓶中121 ℃灭菌20 min 备用。

固体PDA 培养基：液体PDA 培养基中加入20 g琼脂即可制成固体培养基，pH5.5～6.0，分装于各锥形瓶中121 ℃灭菌20 min 备用。

原生质体再生液体培养基：10 g 麦芽糖，4 g 葡糖糖，4 g 酵母粉，溶于0.6 mol/l KCl 渗透压稳定剂中，加水定容至总体积为1 000 mL，分装于各锥形瓶中121 ℃灭菌20 min 备用，此培养基用于原生质体再生。

原生质体再生固体培养基：上述培养基中加入20 g 琼脂即可制成固体培养基，pH5.5～6.0，分装于各锥形瓶中121 ℃灭菌20 min 备用。

1.3 酶液配制

溶壁酶：广东微生物所提供，用0.6 mol/L KCl 渗透压稳定剂配制浓度为1.5%酶液，轻轻摇匀，使得溶壁酶充分溶解，无菌条件下再用0.45 μm 微孔滤膜过滤除菌，收集滤液。

蜗牛酶：广东微生物所提供，用0.6 mol/L KCl 渗透压稳定剂配制浓度为1.5%酶液，轻轻摇匀，使得蜗牛酶充分溶解，无菌条件下再用0.45 μm 微孔滤膜过滤除菌，收集滤液。

1.4 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）融合剂配制

称取5 g 的PEG-4000 粉末，加入适量超纯水和0.2 mL 1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.5）、1 mL 1 mol/L CaCl2溶液，加热至60 ℃，溶解充分后定容至20 mL，2 μm 孔径滤膜过滤除菌，用2.0 mL 无菌离心管分装，存于-20 ℃备用。

1.5 主要仪器设备

智能恒温震荡培养箱（ZHP-250 型）：上海三发科学有限公司；分析天平（BS124S）：赛多利斯（北京）公司；台式高速离心机（TGL20M-Ⅱ）：盐城市凯特实验仪器有限公司；电子显微镜（BM1000）：南京江南永新光学有限公司；超纯水过滤装置（022246）：RES.JSCIENTIFIC INSTRUMENTSCO.LTD；超净工作台（SWCJ-ICW）：苏州安泰空气技术公司。

2 试验方法

2.1 菌丝体培养

将金针菇（F1）和平菇（P8）菌丝接种于平板，待长满平板后，切取最前端生长旺盛的菌丝分别转接到50 mL 的PDA 液体培养基中，接种后置于25 ℃恒温培养箱中培养5 d，在无菌条件下将已培养好的菌丝置于刻度离心管中，挑出培养基块，用无菌水和渗透压稳定剂各冲洗3 次，4 000 r/min 离心10 min，弃上清液收集菌丝体，待用。

2.2 原生质体的制备

原生质体的制备参照文献[6-9]。收集到的菌体分别用无菌水和稳渗剂清洗，吸干，称重，按酶液（溶壁酶与蜗牛酶酶液按体积比1 ∶1 混匀）与菌丝为 1 ∶150（g/mL）加酶解液，置30 ℃下恒温酶解3 h，隔时摇动，并镜检原生质体释放情况。酶解完毕后，滤液于4 000 r/min离心10 min，弃上清液收集沉淀，用0.6 mol/L 稳渗剂洗涤2 次，并加2 mL 0.6mol/L 稳渗剂充分混溶稀释后用血球计数板计数，备用。

2.3 原生质体的灭活

平菇（P8）原生质体采用水浴法100 %灭活，取纯化后的原生质体悬液4 mL 于10 mL 无菌离心管中，置于65 ℃恒温水浴中灭活30 min，其间不断摇动离心管使之均匀受热。

2.4 金针菇与平菇原生质体的融合与再生

原生质体的融合与再生参照文献[10-15]。将上述制备好的金针菇（F1）和平菇（P8）原生质体溶液各1 mL 混匀后于3 000 r/min 离心10 min，弃上清，加2 mL 25 %PEG 和0.2 mol/L CaCl2溶液助融剂，混匀后于32 ℃下温育25 min，之后冰浴20 min，随后离心，去除融合剂，用稳渗剂清洗2 次，加入再生液体培养基在冰上放置10 min。25 ℃静置培养2 d 随后采用涂布法涂布于固体PDA 培养基平板再生，置34 ℃培养箱中培养后观察计数。

2.5 融合子鉴定

对可在34 ℃培养箱中生长的菌落，进一步进行菌落表型、索状联合和拮抗试验进行鉴定。经过鉴定之后选取与母种具有明显形态差异，具有拮抗性且具有锁状联合的菌株来进行出菇试验，出菇试验是在恒温17 ℃条件下培养[16-17]，常规管理，以此来鉴定融合子菌株。

3 结果与分析

3.1 金针菇和平菇原生质体的制备

在前期研究的基础上，以菌龄5 d 的菌丝体为原料，采用1.5%溶壁酶和1.5%蜗牛酶（体积比1 ∶1），置30 ℃下恒温酶解3 h，0.6 mol/L KCl 溶液为渗透压稳定剂，制备得到平菇与金针菇原生质体，利用显微镜对其观察，结果如图1。

图1 平菇和金针菇原生质体（×10）Fig.1 Protoplasts from Flammulina velutipes（Curt.）Singer and Pleurotus ostreatus（×10）

可以看出此方法下金针菇及平菇都可以获得较好的原生质体得率，可继续进行下一步融合研究。

3.2 热灭活平菇及金针菇原生质体再生情况

为了验证平菇原生质体热灭活效果及金针菇原生质体再生情况，进行了金针菇和灭活平菇的再生试验，利用1 mL 稀释的金针菇和灭活平菇原生质体涂布在原生质体再生固体培养基平板，结果如图2。

图2 金针菇和平菇原生质体再生情况Fig.2 Regeneration between Flammulina velutipes（Curt.）Singer and Pleurotus ostreatus Protoplasts

培养10 d 后发现金针菇原生质体活性很高，出现大量再生菌落。而灭活平菇原生质体未出现再生菌落，表明平菇原生质体全部失去再生活性。

3.3 融合子的再生

本试验用置34 ℃培养箱中培养作为标记筛选出融合子，即灭活后的平菇原生质体与金针菇原生质体只有异源互补的融合子才能在34 ℃下再生。两原生质体混匀后加助融剂融合，涂布平板再生，若能再生出菌落，则基本能够鉴定为融合子，本研究获得18 个可在34 ℃生长的单菌落，结果见图3。

图3 融合子、金针菇和平菇原生质体在34 ℃条件下培养生长情况Fig.3 Fusant，Flammulina velutipes（Curt.）Singer and Pleurotus ostreatus protoplast culture at 34 ℃

3.4 融合子的鉴定

挑取在34 ℃培养可生长的菌落转接至平板，置于25 ℃培养后选取1 株菌丝体形态明显差别与亲本的融合子，称为F1P8 金针菇菌株，见图4。

由图4 可知，融合子菌丝比金针菇母种菌丝更加致密，更加洁白，更加有质感。同时与亲本平菇相比，气生菌丝相对较短，质感不够强，但比平菇菌丝致密。

图4 融合子F1P8 和亲本金针菇、平菇的菌丝形态比较Fig.4 Colony characteristics of fusant and parent strain Flammulina velutipes（Curt.）Singer and Pleurotus ostreatus

对于所挑取到的菌落进行的拮抗试验观察见图5。

图5 融合子F1P8 和亲本金针菇（F1）、平菇（P8）的拮抗性鉴定Fig.5 Antagonistic effect observations between fusant and Flammulina velutipes(Curt.)Singer and Pleurotus ostreatus

如果融合子有别于两亲本，则与亲本菌落间应形成对峙带即拮抗线。金针菇、平菇和F1P8 融合子3 个菌株间存在一定的拮抗性，随着培养天数的增多，两亲本与融合子的菌丝会继续生长，但没有出现交叉生长的情况，充分说明了菌种间具有的差异性。

将上面获得的菌株进行插片培养，4 d 后，菌丝铺满插在培养基上面的盖玻片。小心取出盖玻片，直接放置在显微镜下镜检。经显微镜观察菌丝形态，F1P8菌株具有锁状联合的菌株，说明拟融合子是双核菌株，可以进行正常出菇。菌丝的锁状联合结构如图6所示。

图6 融合子锁状联合观察Fig.6 The observation of putative fusant strain F1P8 clamp connection

经过拟融合子初步筛选，我们将筛选的拟融合子进行出菇试验，如图7。

图7 亲本金针菇（F1）和融合子金针菇（F1P8）的出菇情况Fig.7 Fruiting experiment of Flammulina velutipes（Curt.）Singer and fusant strain F1P8

由图7 可以观察到拟融合子菌株与原种相比较不易开伞、菇体粗壮、菇形整齐，出菇数目较多。出菇试验表明，金针菇（F1）和平菇（P8）融合之后产生了市场前景好的子实体为白色的、原基形成较多，产量有所提高、菇形好的金针菇新品种，我们命名为金针菇F1P8。

4 结论

金针菇与平菇两种原生质体融合的最佳条件为：热灭活平菇原生质体1 mL（1×107/mL），加入金针菇原生质体 1 mL（1×107/mL），再加入 2 mL 25 %PEG 融合剂，在32 ℃下温育25 min，之后冰浴20 min，随后离心，去除融合剂，用稳渗剂清洗2 次，加入再生液体培养基在冰上放置10 min，25 ℃静置培养2 d 随后涂布于再生培养基，金针菇与平菇原生质体融合的效果较好。平菇原生质体置于65 ℃恒温水浴中灭活30 min，致死率达100%。

融合子与两亲本的菌落表型明显不同，在菌丝形态以及出菇试验的子实体形态都有所不同，并且融合子与两亲本有一定的拮抗性。但是耐高温特性在传代过程中丢失，说明远缘亲本原生质体融合所得融合子遗传不稳定，仍需要不断探索。平菇、金针菇都是典型的四极性担子菌，其可育性菌体为双核单倍体，这不同于双倍体的植物细胞，核行为有其特殊性，在整个营养生长阶段和子实体生长发育前期，菌体细胞中的2 个异源核是各自独立分裂的。因此，只要2 个异源核能在菌体生长过程中同步分裂，均等分配，就能形成稳定的融合子。这可能是本研究融合子最终丢失耐高温遗传性状的原因。担子菌远缘亲本原生质体融合为食用菌育种提供了广阔前景，但尚未达到定向选育水平，融合子的遗传特性表达将是有待重点研究的问题[18]。