许艳红，于士军，陈磊，于爱文，柴新义，王维坤

（1.滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州239012；2.福建农林大学食品科学学院，福建福州350002；3.通用生物系统（安徽）有限公司，安徽滁州239000）

蝉花（Isaria cicadae），又名金蝉花、蝉虫草、蝉茸等，隶属于麦角菌科、蝉棒束孢菌属，是寄生在蝉幼虫上的一种昆虫真菌，由虫和孢梗束两部分组成[1]。现代药理研究表明蝉花具有双向免疫调节[2]、抗肿瘤[3-4]、改善肾功能[5]、降血糖[6]、抗衰老[7]、镇痛[8]等作用。蝉花又是一种营养价值很高的食用菌，其中含有多种生物碱、多糖、核苷类成分、虫草酸、蛋白质、多种必需氨基酸、环肽化合物、甘露醇、麦角甾醇等有效成分[9-12]。现今对蝉花的利用还停留在作为药物的初级产品上，而深加工产品还比较少见。要开发深加工产品，对蝉花展开深层次利用就需要深入研究蝉花中的活性成分。因此，现今要研究的重点问题就是蝉花孢梗束中化学成分的提取检测与利用问题。

在蝉花孢梗束活性成分中麦角甾醇的获得是相当具有吸引力的。这种甾醇在紫外线的照射下，发生一系列的变化可转化成维生素D2，因此其可以作为一种重要的维生素D 源，以及重要的医药中间体和食品添加剂，发挥人体对钙吸收和利用的促进作用，对骨质疏松和佝偻病的治疗具有一定的功效。它还表现出一定的抗氧化性和抗炎性以及抗高血脂症等作用，并且麦角甾醇过氧化物还具有潜在的抗癌性[5，13]。此外，麦角甾醇还能作为测定生物量的重要指标，与葡糖胺相比，其更具特征性，因此可以用于真菌生物量的测定[14]。在现阶段寻求一种简便快速、无毒安全、高效节能的绿色萃取麦角甾醇的技术是研究的热点。近年来，超声-微波协同提取技术以不限制物料尺寸、不需要载气、热解速度快、易于控制、强选择性以及操作简便、副产物少等优点，被应用于天然活性成分的提取[15]，而有关超声-微波协同辅助提取蝉花孢梗束麦角甾醇鲜见报道。

本文以蝉花虫草孢梗束粉为研究对象，采用超声波协同微波辅助提取麦角甾醇，在单因素试验的基础上，通过响应面法优化工艺参数，以提高麦角甾醇的产量，以期对蝉花孢梗束麦角甾醇的提取工艺的后续研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蝉花虫草孢梗束粉：滁州学院生物与食品工程学院实验室培养；麦角甾醇对照品（纯度99%）：上海金穗生物科技有限公司；去离子水：滁州学院生物与食品工程学院实验室自制；95%乙醇（分析纯）、三氯甲烷（分析纯）：上海振企化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（HPLC-310）：江苏天瑞仪器股份有限公司；微波-紫外-超声波三位一体萃取反应仪（UWave-1000）：上海新仪微波化学科技有限公司；洁盟牌超声清洗机（JP-020）：深圳市洁盟清洗设备有限公司；台式低速大容量离心机（湘仪L-550）：上海申光仪器仪表有限公司；新世纪紫外可见分光光度计（T6）：北京普析通用仪器有限责任公司；分析天平（FA2204B）、电子天平（JA5003J）：上海越平科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蝉花孢梗束麦角甾醇的提取和检测

1.3.1.1 麦角甾醇提取

蝉花孢梗束粉→浸泡12 h→超声波协同微波辅助提取→离心（4 000 r/min，10 min）→取上清液→过滤→高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析[16]。

1.3.1.2 高效液相色谱检测条件

色谱柱：Agilent C18反相色谱柱（C184.6 mm×250 mm，5 μm）；检测器：紫外灯光检测器；流动相：甲醇；检测波长：282 nm；柱温：35 ℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；采样时间：15 min[17]。

1.3.1.3 标准曲线的绘制

准确称取麦角甾醇标准品10 mg，溶解于无水乙醇中，配成质量浓度为0.1 mg/mL 标准储备液。分别吸取 0、1、2、4、8、10 mL，各自用无水乙醇补至 10 mL，配制成浓度分别为 0、10、20、40、80、100 μg/mL 的标准品溶液，用0.22 μm 滤膜过滤后采用高效液相色谱法进行测定，根据标准品浓度和峰面积计算回归方程。

1.3.2 方法学考察

1.3.2.1 精密度试验

吸取浓度为10 μg/mL 的麦角甾醇对照品溶液10 μL，采用1.3.1 的检测方法检测5 次，记录峰面积并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值。

1.3.2.2 重复性试验

称取蝉花孢梗束粉样品5 份，各0.25 g，分别加入20 mL 95%乙醇溶解，浸泡12 h，在超声波功率100 W，微波功率 100 W，液料比 80 ∶1（mL/g）条件下提取15 min，将样品溶液分别进行测定，记录峰面积并计算相对标准偏差。

1.3.2.3 稳定性试验

称取蝉花孢梗束粉样品0.25 g，加入20 mL 95%乙醇溶解，浸泡12 h，在超声波功率100 W，微波功率100 W，液料比 80 ∶1（mL/g）条件下提取 15 min，样品溶液按 1.3.1 检测方法分别隔 0、4、8、12、24 h 测定，记录峰面积并计算相对标准偏差。

1.3.2.4 加标回收率试验

称取蝉花孢梗束粉样品3 份，各0.25 g，分别加入3、4、5 mL 100 μg/mL 麦角甾醇标准溶液，提取液按1.3.1检测方法分别进行测定并计算相对标准偏差[18]。

1.3.3 蝉花孢梗束麦角甾醇的计算

采用高效液相色谱法得到的峰面积代入标准曲线计算出麦角甾醇的质量浓度，采用下面公式计算出蝉花孢梗束麦角甾醇提取得率[19]。

式中：X 为标准曲线计算得出的麦角甾醇的质量浓度，mg/mL；V 为提取溶液的总体积，mL；m 为蝉花孢梗束粉质量，g。

1.3.4 超声波-微波提取麦角甾醇的工艺优化

1.3.4.1 单因素试验

1）提取时间对蝉花孢梗束麦角甾醇提取得率的影响

称取蝉花孢梗束粉末0.25 g，在提取溶剂为95%乙醇，超声波功率100 W，微波功率100 W，液料比80 ∶1（mL/g）的条件下，设置提取时间为 5、10、15、20、30 min 5 个水平，研究提取时间对蝉花孢梗束麦角甾醇提取得率的影响，每个水平重复3 次[16]。

2）乙醇浓度对蝉花孢梗束麦角甾醇提取得率的影响

称取蝉花孢梗束粉末0.25 g，在超声波功率100 W，微波功率 100 W，液料比 80 ∶1（mL/g），提取时间 15 min的条件下，设置乙醇浓度为35%、50%、65%、80%、95 %5 个水平研究乙醇浓度对蝉花孢梗束麦角甾醇提取得率的影响，每个水平重复3 次[20]。

3）液料比对蝉花孢梗束麦角甾醇提取得率的影响

称取蝉花孢梗束粉末0.25 g，在提取溶剂为95%乙醇，超声波功率100 W，微波功率100 W，提取时间15 min 的条件下，设置液料比为 20 ∶1、40 ∶1、60 ∶1、80 ∶1、100 ∶1（mL/g）5 个水平，研究液料比对蝉花孢梗束麦角甾醇提取得率的影响，每个水平重复3 次[21]。

4）超声波功率对蝉花孢梗束麦角甾醇提取得率的影响

称取蝉花孢梗束粉末0.25 g，在提取溶剂为95%乙醇，液料比 80 ∶1（mL/g），微波功率 100 W，提取时间15 min 的条件下，设置超声波功率为 50、75、100、125、150、200 W 5 个水平研究超声波功率对蝉花孢梗束麦角甾醇提取得率的影响，每个水平重复3 次。

1.3.4.2 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以95%的乙醇为提取溶剂，麦角甾醇提取得率为响应值，提取时间、超声波功率、液料比为自变量进行条件优化。采用Box-Behnken三因素三水平进行试验设计。试验因素水平和编码见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4 数据处理

试验数据采用IBM-SPSS-Statistics 19 软件进行单因素方差分析，组间差异用Duncan 新复极差法检验；利用Design-Expert 8.0 软件进行响应面分析；数据图采用Origin Pro 8.5.1 进行绘制。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

按照1.3.1 的方法进行标准曲线的绘制，以峰面积为纵坐标，麦角甾醇浓度（μg/mL）横坐标得到的线性回归方程：Y=2 460.6X+3 138.6，R2=0.999 9，结果显示，浓度在 10 μg/mL～100 μg/mL 范围内有良好的线性关系。采用浓度为10 μg/mL 的麦角甾醇对照品溶液，按1.3.1 色谱条件进样检测5 次，得到结果的RSD 为0.35%，表明该方法的精密度良好。经1.3.2 的重复试验方法处理样品进行检测，测定5 次，得到的结果的RSD 为0.29%，表明该方法的重复性良好。经1.3.2 的稳定性试验方法处理样品进行检测，得到的结果RSD 0.72%，表明样品在24 h 内是稳定的。按1.3.2 的加标回收试验方法处理样品进行检测，得到的结果平均回收率为99.90 %，RSD 为1.82 %，表明试验回收率较好。

2.2 单因素试验分析

提取时间、乙醇浓度、液料比、超声波功率对麦角甾醇提取得率的影响见图1。

图1 提取时间、乙醇浓度、液料比、超声波功率对麦角甾醇提取得率的影响Fig.1 The effects of extraction time，ethanol concentration，liquid-solid ratio，ultrasonic power on the yield of ergosterol

由图1（A）可知，在提取时间为15 min 内，麦角甾醇提取得率随提取时间的增加而显著提高，10 min～15 min 内上升最快，差异最为显著（P<0.05），在15 min左右麦角甾醇的提取得率达到最大值，提取时间延长，麦角甾醇的提取得率又显著降低。可能是随着提取时间延长，微波作用下溶液内局部温度上升过快，一方面导致麦角甾醇分子变性，另一方面温度波动过大可能导致乙醇挥发过多，从而使得乙醇浓度降低，致使麦角甾醇的提取得率降低[22]。故选择提取时间为15 min 较为合适。

由图1（B）可知，在试验范围内蝉花孢梗束麦角甾醇提取得率随乙醇浓度的增加而不断提高，提取溶剂为95%的乙醇溶液时，麦角甾醇提取得率最高。乙醇浓度从50%到80%时，麦角甾醇的提取得率上升最快，乙醇浓度从80%到95%时，麦角甾醇提取得率上升缓慢，乙醇浓度为35%、50%、65%、80%时麦角甾醇提取得率与95%时的麦角甾醇提取得率差异显著（P<0.05）。考虑到实验室资源以及麦角甾醇提取得率随乙醇浓度升高的变化趋势，故选择95%的乙醇溶液为提取溶剂。

由图1（C）可知，不同液料比麦角甾醇的提取得率差异显著（P<0.05），且液料比从 20 ∶1（mL/g）开始变化时，随着液料比的增大麦角甾醇的提取得率提高，料液比达到80 ∶1（mL/g）左右时，提取得率达到最大值，此后随着液料比的增大，麦角甾醇的提取得率有所降低。用溶液从固体中萃取目的物质时，液料比不同导致液相、固相之间的浓度差的不同，从而传质推动力就会出现快慢，影响提取效果[22]。开始时由于液体过少，不足以萃取出麦角甾醇从而导致麦角甾醇提取率低，而随着液料比增加，有效成分溶出也增加；但达到一定程度时其他成分溶出也增加，反而影响目标物的提取或可能是因为溶剂量过大时微波和超声的能量过多作用于溶剂，物料吸收的能量反而变少，从而导致麦角甾醇的溶出量下降。因此，选择液料比80 ∶1（mL/g）为最佳比例。

由图1（D）可知，超声波功率为 50、75 W 与 100 W时的麦角甾醇的提取得率差异显著（P<0.05），超声波功率为125、150 W 与100 W 时的麦角甾醇的提取得率差异不显著（P<0.05），开始时随着超声波功率的增加，麦角甾醇的提取得率增加，超声波功率为100 W左右时麦角甾醇的提取得率最大，功率再增加麦角甾醇提取得率有所降低。这可能是因为随着超声波功率的增大，超声产生的空化效应就越强，细胞破碎的就越彻底[16]，从而麦角甾醇就能有效的溶出，但超声波功率继续增大对麦角甾醇的提取没有多大的效果，甚至可能会降低其提取得率。因此，选择超声波功率100 W较为合适。

2.3 响应面试验优化

2.3.1 响应面试验结果与分析

在单因素试验结果的基础上，以95%乙醇溶液为提取溶剂，采用响应面法优化超声波协同微波辅助提取蝉花孢梗束麦角甾醇工艺中提取时间、液料比、超声波功率3 个参数。以麦角甾醇提取得率为响应值，利用Box-Behnken 的原理，采用Design-Expert 8.0 进行设计，试验方案和结果见表2。

表2 响应面试验方案与结果Table 2 Response surface test designs and extraction results

利用Design-Expert 8.0 软件对表2 中数据进行回归分析，建立提取时间、超声波功率、液料比与蝉花孢梗束麦角甾醇提取得率之间的回归模型，回归方程为：

该回归模型的可靠性可由结果分析和相关系数来判定，分析结果如表3 所示。

表3 回归统计分析结果Table 3 Results of regression statistics analysis

续表3 回归统计分析结果Continue table 3 Results of regression statistics analysis

当P<0.05 时，则表示判定指标是显著的。运用二次模型的变异分析，结果表示，建立的蝉花孢梗束麦角甾醇提取的模型中二次多项失拟项不显著，模型极显著（P<0.01），且由回归模型的相关系数R2=0.953 5可知，该模型能解释95.35%的响应值的变化。因此，该模型的拟合度较好，可用于蝉花孢梗束麦角甾醇提取的分析和预测。一次项X1、X3不显著，X2极显著；二次项 X22极显著、X32显著，X12不显著；交互项 X1X3极显著，X1X2、X2X3不显著；由F 值可以看出影响超声协同微波提取蝉花孢梗束麦角甾醇的主次因素：X2超声波功率>X3液料比>X1提取时间。

提取时间、超声波功率和液料比对麦角甾醇提取得率的影响的响应面和等高线见图2。

图2 提取时间、超声波功率和液料比对麦角甾醇提取得率的影响的响应面和等高线Fig.2 Response surface plots and contour plots for effects of extraction time，ultrasonic power，and liquid-solid ratio on the yield of ergosterol

用Design-Expert 软件得到相应的响应面图和等高线图，分析这些因素对麦角甾醇提取得率的交互影响。响应面图中图的坡度越大则表明麦角甾醇的提取得率变化得越快，也即表明对麦角甾醇提取得率的影响更为显著。而等高线图中可以更加直观地看出各个因素对麦角甾醇提取得率的影响，从而可以更好的找出最佳工艺参数；等高线中最小椭圆的中心即为响应面的最高点，且等高线的形状可以反映交互影响的强弱，椭圆即为影响显著，圆形即为不显著[21]。

由图2 可知，提取时间与超声波功率对麦角甾醇提取得率的交互影响呈抛物线形，等高线形状比较接近圆。提取时间与液料比对麦角甾醇提取得率的交互影响的呈抛物线形，等高线图为椭圆。超声波功率与液料比对麦角甾醇的交互影响的呈抛物线形，等高线形状最接近圆。说明提取时间和液料比对麦角甾醇提取得率的交互影响最为显著，提取时间和超声波功率以及超声波功率和液料比对麦角甾醇的交互影响不显著。且由3D 响应面图可知，超声波功率与提取时间、液料比相比，其效应曲线比较陡，超声波功率等高线密度高于其余两个因素的等高线密度，说明超声波功率较提取时间、液料比对麦角甾醇提取得率的影响更为显著。

2.3.2 最佳工艺的验证

由Design-Expert 模拟获得的最优组合为提取时间15.42 min、超声波功率 119.12 W、液料比 82.58（mL/g），预测值为2.64 mg/g。为验证模型的准确性，微调变量参数得组合提取时间15 min，超声波功率120 W，液料比 80 ∶1（mL/g），微波功率 100 W，95%乙醇为提取溶剂的条件下进行提取，做3 个平行，得到麦角甾醇平均提取得率为2.68 mg/g，与预测值接近（P<0.05）。结果证明响应面法优化超声波协同微波辅助提取蝉花孢梗束麦角甾醇的工艺条件是可行的。

3 结论

确定提取溶剂时，曾采用蒸馏水、甲醇、乙醇、三氯甲烷提取蝉花孢梗束麦角甾醇，结果发现采用三氯甲烷与95%乙醇提取得率差异不明显（P<0.05），且是最高的。陈红梅[23]对红曲中麦角甾醇提取时发现三氯甲烷提取率高，但三氯甲烷易挥发，对心、肝、肾有损害，遵循食品行业的安全性原则采用乙醇这种无毒无害试剂进行提取。且王禄禄等[16]对元蘑中麦角甾醇提取时发现无水乙醇提取率最高。

本研究结合了超声波协同微波辅助萃取技术，在单因素试验基础上采用响应面法优化了蝉花孢梗束麦角甾醇提取工艺，确定的最佳工艺为：提取时间15 min，超声波功率 120 W，液料比 80 ∶1（mL/g），提取溶剂95%乙醇，微波功率100 W。在最佳工艺条件下，得到的麦角甾醇提取得率为2.68 mg/g，与在本实验室条件下采用超声波破碎法[24]从蝉花孢梗束中得到的麦角甾醇提取得率2.13 mg/g 相比，高出25.82%，提高了蝉花孢梗束麦角甾醇的提取得率。且与传统的水浴锅加热法提取[17，20]相比大大缩短了提取时间，操作更加简便，选择性更高，热解速度快。该提取工艺对蝉花孢梗束麦角甾醇的相关研究提供参考，对于蝉花孢梗束的进一步利用具有重要意义。