田丁元，党连生

静脉血栓栓塞症（venous thromboembolism，VTE）包括深静脉血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）和肺血栓栓塞症（pulmonary thromboembolism，PTE），是同一疾病的两个不同阶段，具有高漏诊率、高病死率、易复发等特点［1］。临床上，DVT来源的栓子被认为是发生PTE 的主要因素，且未经治疗的DVT极易发生PTE，因此，预防致命性肺栓塞的根本途径是提高隐匿性DVT的早期诊断率［2］。《肺血栓栓塞症诊治与预防指南》（以下简称《指南》）指出无论是内科住院患者还是外科手术患者，发生VTE 的风险均高达40%～60%［3］，并且多数患者因症状不典型易出现漏诊、误诊的情况，给患者的生活质量带来了巨大的危害［4］，因此找到一种快速便捷的方法预测VTE 的发生显得尤为重要。《指南》还指出对于低中危可疑VTE 患者应行D-二聚体检测以指导下一步诊疗，50岁以上患者采取年龄校正后D-二聚体作为辅助诊断指标。有研究指出D-二聚体/纤维蛋白原（D-dimer fibrinogen ratio，DFR）诊断VTE 的特异性优于D-二聚体［5］，但其在老年VTE患者中的诊断意义尚不明确。巨噬细胞炎性蛋白因子-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）是由巨噬细胞、树突细胞等多种细胞分泌的促炎性趋化因子［6］，具有炎症和免疫调节活性。有研究发现MIP-1α可能参与深静脉血栓的形成和溶解过程，主要通过炎症反应发挥生物学效应［7］。但MIP-1α 与老年卧床VTE的相关研究尚少见。本研究旨在探讨MIP-1α和DFR对DVT和PTE的预测价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2017 年6 月—2018 年6 月于我院就诊疑似VTE 的老年患者为研究对象。纳入标准：（1）Padua 评分≥4分［8］。（2）近1个月未应用抗凝药物。（3）年龄≥65岁。（4）卧床≥3 d。排除标准：（1）近1年发生过急性冠脉综合征。（2）慢性肾衰患者，肌酐＞180 μmol/L。（3）近1 个月有急性感染（重症感染或感染中毒症）、创伤或手术治疗。（4）合并严重凝血功能障碍及肝功能损害。（5）既往静脉血栓症。（6）已知具有易栓倾向的病例，如抗凝血蛋白C、蛋白S 和抗凝血酶缺乏，凝血因子V 莱顿（leiden）突变、凝血酶原G20210A 突变，抗心磷脂综合征。按上述标准最终纳入129例患者，其中男59 例，女70 例，平均（75.48±7.21）岁。对所有患者行下肢加压超声（CUS）检查，高度可疑PTE的患者进一步行CT肺血管造影（CTPA），根据检查结果将患者分为非DVT 组74 例，单纯DVT 组34 例，PTE 组21 例。非DVT 组：给予对症治疗；DVT组及PTE组：给予低分子肝素、华法林抗凝治疗，监测国际标准化比值（international normalized ratio，INR），调整药物剂量。本研究已获医院伦理委员会批准，所有患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 实验室指标检测 在抗凝治疗前采集患者新鲜血液标本，收集实验室指标：白细胞（WBC）、中性粒细胞（N）、淋巴细胞（L）、C反应蛋白（CRP）、凝血酶原时间（PT）、部分活化凝血活酶时间（APTT），上述指标的检测均在我院检验科完成，检测过程在质控合格情况下进行，并计算中性粒细胞计数/淋巴细胞计数比值（neutrophil lymphocyte ratio，NLR）。

1.2.2 D-二聚体、纤维蛋白原（FIB）、MIP-1α 水平检测 于抗凝治疗前采集患者静脉血液标本，采用免疫比浊法测定血浆D-二聚体水平，凝固法测定血浆纤维蛋白原水平，D-二聚体测定试剂盒、纤维蛋白原测定试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司，于全自动凝血功能检测仪上进行检测，计算DFR。

采用巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α/CCL3）ELISA 试剂盒（酶免公司）测定血清MIP-1α的水平。根据结果绘制标准曲线，得出直线方程，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品的实际浓度。并计算年龄校正后D-二聚体（Age-adjusted D-dimer）=D-二聚体/（年龄/50）mg/L。比较各组间指标的差异，并通过受试者工作特征（ROC）曲线评价诊断效能。

1.2.3 Real-time PCR 检测MIP-1α mRNA 表达量 （1）引物序列。内参基因GAPDH：上游5´-ACGACCACTTTGTCAAGCTC-3´，下游5´-GAGGAGGGGAGATTCAGTGT-3´，扩增产物长度208 bp；目的基因MIP-1α：上游5´-ACCTCCACAGCTACCTCTT-3´，下游5´-GATCACAGCCCTGAACAA-3´，扩增产物长度292 bp。（2）总RNA 的提取。采用Trizol 法提取总RNA，提取的总RNA经凝胶电泳检测完整性，用紫外分光光度计进行RNA 纯度的检测，纯度合格的总RNA 溶液其OD260/OD280值在1.8～2.0之间，合格的用于逆转录；cDNA合成：用4 μL RNA 进行逆转录反应，严格按照宝生物工程（大连）有限公司逆转录试剂盒Primer Script-RT reagent Kit（Perfect Real Time）说明书操作，反应体系为10 μL；荧光定量PCR：使用SLAN-96S 型Real Time PCR 仪，严格按照TB Green™Premix Ex Taq ™Ⅱ试剂盒宝生物工程（大连）有限公司说明书进行操作，反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40个循环，每个样本设置3个检测复孔，以2-ΔΔCt值代表样本中MIP-1α mRNA的相对表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，3组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，3组间比较采用Kruskal-WallisH检验，组间多重比较行Mann-WhitneyU检验。计数资料组间比较采用χ2检验。应用ROC 曲线下面积（AUC）评价老年VTE 患者各项指标预测价值，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组一般资料比较 3组性别比例、年龄、慢性心功能不全、高血压史、糖尿病史、PT、CRP、WBC、NLR、APTT差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 3组D-二聚体、校正D-二聚体、纤维蛋白原、DFR 水平的比较 PTE 组、DVT 组D-二聚体、校正后D-二聚体、DFR 水平均显著高于非DVT 组（P＜0.05），PTE组与DVT组差异无统计学意义；3组纤维蛋白原差异无统计学意义，见表2。

2.3 3组间MIP-1α水平及MIP-1α mRNA表达量的比较 DVT组、PTE组血清MIP-1α水平高于非DVT组，PTE组血清MIP-1α水平低于DVT组（P＜0.05）。DVT组、PTE组MIP-1α mRNA的相对表达量均高于非DVT组（P＜0.05），见表3。

2.4 各项指标诊断VTE 的预测价值 DFR、MIP-1α、校正后D-二聚体对VTE 的诊断均有诊断价值（P＜0.05），校正后D-二聚体对老年患者VTE 的诊断效能最高，DFR 的诊断效能与传统D-二聚体相当；MIP-1α 对VTE 的诊断价值为中等价值，其对VTE的预测能力一般。NLR对VTE的诊断无预测价值（P＞0.05），见图1、表4。

Fig.1 Receiver operating characteristic(ROC)curves of indicators图1 各项指标的ROC曲线

3 讨论

研究发现炎症与血栓形成密切相关［9］。炎症可增加促凝血因子的生成，抑制天然抗凝血途径和纤维蛋白溶解活性，导致血栓形成。凝血过程也会通过凝血酶诱导促炎细胞因子和生长因子的分泌增加炎症反应的强度，导致恶性循环［10］。越来越多的证据表明，炎症是VTE发生的病理生理学因素［11］。

MIP-1α是趋化因子C-C家族成员，主要由巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、成纤维细胞等分泌，其通过特异性地结合受体继而趋化淋巴细胞、单核细胞向炎症、损伤部位迁移，促进损伤部位的自我修复而发挥作用［12-13］。MIP-1α 的表达还可提高中性粒细胞的浸润程度，促进炎性因子的释放并增加炎症因子对上皮细胞的促凋亡作用［14］，还具有促进胶原纤维蛋白的合成，加剧上皮组织增生和纤维化程度，募集炎性细胞，促使伤口愈合的生物学功能［15］。MIP-1α 在多种炎症性疾病的发病过程中起着重要作用。有研究显示，MIP-1α可能通过诱导炎性因子释放激活信号转导通路而发挥作用，其可能是预测急性胰腺炎严重程度的生物学标志物［16］；MIP-1α还可作为反映脑外伤严重程度的客观指标，其可能通过结合受体刺激炎性因子产生向创伤病灶积聚而加剧局部损伤［17］；血浆MIP-1α 是动脉粥样硬化发生的独立危险因素，其发生机制可能为诱导炎性细胞活化参与血管内皮损伤，从而参与冠心病动脉硬化病理过程［18］。MIP-1α 不仅在炎症反应中发挥重要作用，在血栓形成中也存在一定的生物学效应。Chen等［19］研究发现在小鼠DVT造模后3 d血栓栓子中单核巨噬细胞显著升高，且MIP-1α在栓子中呈逐渐升高趋势，提示MIP-1α可能通过作用于单核巨噬细胞而参与DVT 过程。刘海平等［7］通过建立小鼠DVT 模型观察血栓形成后MIP-1α 与血栓栓子溶解的关系，发现MIP-1α 在DVT 形成后可通过趋化巨噬细胞向静脉血栓处聚集而促进血栓溶解，其中和抗体具有阻断MIP-1α 促进血栓溶解的作用。本研究结果显示，老年VTE 患者血清MIP-1α 水平及其mRNA 相对表达量在PTE 组及DVT 组中均高于非DVT 组，与以往研究结果一致［20-21］，提示MIP-1α 可能是静脉血栓形成及不稳定脱落的标志物，主要通过炎症反应参与疾病的发生发展。

Tab.1 Comparison of general data between three groups表1 3组间一般资料比较

Tab.2 Comparison of plasma levels of D-dimer,corrected D-dimer,fibrinogen and DFR between three groups表2 3组D-二聚体、校正D-二聚体、纤维蛋白原、DFR水平的比较［M（P25，P75）］

Tab.3 Comparison of serum levels of MIP-1α and MIP-1α mRNA expressions between three groups表3 3组血清MIP-1α水平与MIP-1α mRNA表达量的比较

Tab.4 Analysis of receiver operating curves of various indicators for the diagnostic value of VTE表4 各项指标对VTE诊断价值的ROC曲线分析

NLR 是临床常见的炎性标志物，参与多种疾病的发生发展过程，其也被视为机体血栓形成的标志物，尤其在心血管疾病的病理生理过程中起重要作用［22］。D-二聚体是纤维蛋白原交联时的降解产物，来源于静脉血栓纤维基质的降解，是反映凝血激活及继发性纤溶的特异性分子标志物［23］，纤维蛋白原升高是血栓形成的前提，在凝血酶的作用下降解为纤维蛋白，继而相互交联形成血栓，同时激活纤维蛋白溶解系统，因而D-二聚体可以作为纤溶指标，纤维蛋白原可作为凝血指标，DFR即反映纤溶/凝血过程的平衡［24］。有研究表明PTE 可能会使D-二聚体升高而降低纤维蛋白原，在诊断PTE 时DFR 可能具有与D-二聚体相同的重要性［24］。本研究结果显示，MIP-1α对VTE的预测价值不及传统D-二聚体的诊断效能；校正年龄后D-二聚体、DFR 对VTE 的预测价值高于传统D-二聚体，为中等强度；NLR 对VTE无诊断价值，提示对于老年患者VTE 的诊断，校正D-二聚体、DFR更有意义。