施莹，杨子聪，刘海润，薛焱，张舒，黄信顺，卢建勇，刘伶

随着社会老龄化的发展，冠心病和认知功能障碍已经成为威胁人类生活质量的重大慢性疾病。近年来研究发现，冠心病患者发生认知功能障碍的风险较普通人群显著增加，并且两者之间具有许多相同的危险因素，如肥胖、高龄、高血压病史、糖尿病、吸烟史及饮酒史等［1］。除此之外，炎症反应及血管损伤也被发现在冠心病及认知功能障碍的发生发展中发挥着重要作用［2-5］，遗传因素如相关炎性因子的基因多态性与二者的发病风险密切相关［6-7］。白细胞介素（Interleukin，IL）-35 是1997 年由Devergne等［8］发现，是由EBi3及IL-12A（IL-12p35）两个亚基构成的一种异二聚体，分子结构与其他IL-12 家族细胞因子相似。2002 年，IL-35 被正式定义为一种新的抗炎因子［9］。近年来多项研究发现，IL-35在包括心脑血管疾病在内的多种疾病的发生发展过程中发挥着重要作用［10-11］。本课题组前期研究及一项针对墨西哥人群的研究均发现IL-35基因位点多态性可能与冠心病的发病风险存在相关性［12-13］。但目前关于IL-35 基因多态性与疾病易感性的研究尚少见，尤其是针对IL-35 基因多态性与认知功能障碍的相关性研究更为少见。本研究拟对IL-35基因多态性与冠心病患者认知功能障碍的发生风险进行探讨。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2015年2月—2016年10月在广西壮族自治区人民医院心血管内科住院的冠心病患者。纳入标准：首次经冠状动脉造影或典型临床症状及（或）心电图、心肌损伤标志物诊断为冠心病（包括急性心肌梗死）的患者［14-15］。排除标准：（1）有其他严重疾病如恶性肿瘤、严重肝脏疾病、自身免疫性疾病等。（2）有脑实质、血管疾病史（如脑出血、脑梗死、脑外伤）及其他中枢性神经疾病病史（如癫痫、帕金森症）等。（3）有视、听功能障碍或意识障碍不能配合完成认知功能评估者。（4）其他情况不能配合完成认知功能评估者。符合以上标准者共406例，同意参加本项研究者349（86.0%）例，其中男240 例，女109 例，年龄29～78 岁，平均（60.15±7.55）岁。本研究获得广西壮族自治区人民医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基线资料收集 所有研究对象在入院24 h内，由经过培训的研究人员进行基本资料采集，并进行质量控制。包括既往疾病史（如高血压、糖尿病、房颤、脑血管疾病、中枢神经病史等）、吸烟史、饮酒史、认知功能障碍家族史、特殊用药史、身高、体质量、教育水平等；其中吸烟史根据世界卫生组织关于吸烟的定义，连续或累计吸烟6个月或以上者定义为有吸烟史者；饮酒史定义为每周饮酒至少2次，连续饮酒1年以上；教育水平：未接受正规教育者为文盲、接受小学教育者为小学，完成小学教育，接受中学教育及以上教育者为中学及以上。

1.2.2 认知功能评估 所有研究对象在入院24 h内，由广西壮族自治区人民医院认知睡眠中心精神病学副主任医师及经过培训的研究人员使用简易精神状态检查量表（minimental state examination，MMSE）进行认知功能评估，并进行质量控制。MMSE量表共包含19个项目，总分为30分，主要对研究对象的定向、记忆、语言、计算和注意力等功能进行评定，根据国内标准，因教育程度不同，文盲组总分17分以下，小学组总分20 分以下，中学或以上组总分24 分以下者定义为认知功能损伤［16］。根据评估结果将患者分为认知功能正常组（对照组）205例和认知功能损伤组（病例组）144例。

1.2.3 临床生化指标检测 所有研究对象于入院次日清晨空腹采血，标本送广西壮族自治区人民医院检验科按临床标准流程进行检测，使用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖（fast blood glucose，FBG）；酶法检测低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）；干化学层析法测C-反应蛋白（C-reaction protein，CRP）；乳酸脱氢酶法测丙氨酸转氨酶（ALT）；酶法测天冬氨酸转氨酶（AST）；尿酸氧化酶法测尿酸（uric acid，UA）；酶法检测肌酐（creatinine，Crea）等，使用改良MDRD 公式：170×（Scr）-1.234×（年龄）-0.179×（0.79 女性）计算肾小球滤过率（eGFR）。根据ELISA 试剂盒（LifeSpan Biosciences Inc.，Seattle，Washington，USA）说明书操作流程检测血浆IL-35水平，检测有效范围为15.63～1 000 ng/L。

所有研究对象在入院48 h 内行心脏彩超检查，使用 Simpson 法对左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、短轴缩短率（fractional shortening，FS）等指标进行测量。

1.2.4 DNA 提取 所有研究对象均于入院次日清晨空腹采血5 mL，使用EDTA 抗凝，离心机分离全血后将血浆及浓缩全血细胞分别置于-80 ℃冰箱保存。严格按照使用说明书提取DNA（Gentrasystems，Inc.，Minneapolis，MN，USA）。

1.2.5 IL-35 基因多态性位点选择 基于Hapmap、NCBISNP 及Genomes 数据库进行研究位点选择，包括：（1）最小等位基因频率（Miner Allele Frequency，MAF）≥0.1 且r2≥0.8，选取TagSNP 基因位点。（2）优先选取5´UTR、3´UTR、启动子（5´near gene）、外显子等功能区单核苷酸多态性（SNPs）位点及参考文献［7］中报道的疾病易感性为阳性的位点进行研究。（3）根据连锁不平衡（Linkage disequilibrium，LD）分析结果，对完全连锁位点（r2=1）进行筛选。根据以上原则，选择rs582054、rs2243115、rs428253、rs583911、rs568408 及rs4740进行研究。

1.2.6 基因分型 使用Sequenom Mass Array 系统对所研究SNP位点进行基因分型。各位点引物序列见表1。PCR反应体系：PCR 反应缓冲液（5 mmol/L MgCl20.325 μL、15 mmol/L MgCl20.625 μL、25 mmol/L dNTP 0.100 μL），二次蒸馏去离子纯净水1.850 μL，500 nmol/L 引物混合物1.000 μL，5 U/μL HotStarTaq 0.100 μL，DNA样本1 μL。PCR扩增程序：94 ℃5 min；94 ℃20 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，45 个循环；72 ℃3 min，4 ℃至终止。然后加入SAP Mix反应液，继续40个循环：94 ℃30 s；94 ℃5 s，52 ℃5 s，80 ℃5 s；72 ℃3 min，4 ℃至终止，使用MALDI-TOF质谱仪分析树脂纯化后的反应产物。

Tab.1 Primers for PCR表1 PCR引物列表

1.3 统计学方法 使用SPSS 19.0软件进行统计分析。采用K-S检验对连续型变量进行正态性分布检验，符合正态分布的连续型变量以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；不符合正态分布的连续型变量以M（P25，P75）表示，组间比较采用H检验或Mann-WhitneyU检验。计数资料组间比较采用χ2检验。Hardy-Weinberg 平衡定律检验各组样本代表性。影响因素分析采用二元Logistic 回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者基本临床资料比较 病例组年龄、FBG 和ALT 均明显高于对照组（P＜0.05）；2组间性别比例、吸烟史、饮酒史、房颤史、认知功能家族史、教育水平、体质量指数（BMI）、TC、TG、LDL-C、CRP、eGFR、血浆IL-35 水平差异均无明显统计学意义，见表2。

Tab.2 Comparison of the general clinical characteristic between the two groups表2 2组患者基本临床资料比较

2.2 2组基因分型结果 各位点基因分型检出率分别为：对照组rs428253（93.7%）、rs4740（95.6%）、rs2243115（98.5%）、rs568408（95.6%）、rs582054（98.5%）及rs583911（97.1%）；病例组rs428253（94.4%）、rs4740（97.9%）、rs2243115（99.3%）、rs568408（97.9%）、rs582054（98.6%）及rs583911（98.6%）。 2组 rs428253、rs4740、rs2243115、rs568408、rs582054及rs583911符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），病例组和对照组样本均具有群体代表性，见表3。

2.3 冠心病患者IL-35基因位点多态性与认知功能障碍的相关性 以是否认知功能障碍（否=0，是=1）为因变量，基因分型为自变量，校正吸烟史、饮酒史、高血压、糖尿病病史、认知功能障碍家族史、年龄、ALT及空腹血糖水平，进行Logistic回归分析。结果显示，冠心病患者中IL-35 基因rs428253、rs4740、rs2243115、rs568408、rs582054 及rs583911 位点多态性与认知功能障碍发生无明显相关性，见表4。

3 讨论

认知功能一般包括理解力、记忆力、注意力，是正确感知周围环境、处理解决问题的基础。而认知功能障碍作为老年期痴呆的前兆症状之一，是介于正常衰老和痴呆之间的一种认知损伤状态，具有发展为痴呆的高度风险，可严重影响中老年人群的健康及生活质量，其患病率呈逐年递增的趋势［17-18］。有数据显示，冠心病患者认知功能障碍的患病率较普通人群明显增高，可达35%～46%，并且与认知功能障碍具有许多相同的危险因素，包括炎症反应、遗传因素及血管性损伤等［19-20］。冠心病病理基础为血管动脉粥样硬化，炎症反应、遗传因素及自身免疫调节失衡也已被证实与冠心病的发生发展密切相关。小胶质细胞作为中枢神经系统中的天然免疫细胞，激活后可通过IL-1β、IL-6 及肿瘤坏死因子（TNF）-α等炎性因子的释放，引起神经元的丢失及变性，从而引起大脑的损伤，导致认知功能障碍。有研究发现，炎性因子IL-6-174G＞C位点C等位基因携带者较G 携带者IL-6 水平更高，并且随访1 年后认知功能损伤更重［21］。另有研究发现，TNF-α-1031T/C 基因多态性与慢性精神分裂症患者认知功能障碍发病风险密切相关［22］。目前关于IL-35基因多态性与疾病易感性的关联研究较少，尤其是与认知功能障碍的相关性，因此本研究对IL-35 基因多态性与冠心病患者认知功能障碍的发病风险进行了探索。

Tab.3 The distribution of genotype in the two groups表3 2组基因型分布频率［例（%）］

Tab.4 Association between interleukin-35 polymorphisms and the risk of cognitive impairment in CHD patients表4 冠心病患者IL-35 SNPs与认知功能障碍的相关性

IL-35 作为IL-12 家族的一员，主要由调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）分泌，其在调节炎症反应及自身免疫失衡中发挥着重要作用，与其受体结合后发挥抗炎及免疫抑制作用。本课题组前期研究发现冠心病患者IL-35 水平较对照组明显降低，并且与冠心病患者LVEF 呈正相关［11，23］，提示IL-35在动脉硬化及冠心病的发生发展中发挥着重要作用。故笔者推测IL-35可能也参与了血管性认知功能障碍的发生及发展。另外，研究发现IL-35 基因多态性与冠心病的发病风险存在相关性，rs428253 位点CC基因型携带者冠心病的发病风险较GG型携带者明显增高［12-13］。同时IL-12A 作为IL-35 的亚基之一，一项对IL-12A rs2243115 及rs568408 基因多态性与中国北方汉族人群阿尔茨海默病的关联性研究结果显示，携带rs568408 TT基因型的研究对象与携带GG 基因型相比，阿尔茨海默病发病风险明显降低［6］。以上研究结果提示IL-35 分子相关基因位点多态性与动脉粥样硬化性疾病及认知功能障碍存在关联。但本研究结果显示，病例组与对照组IL-35水平无明显差异，且未发现IL-35 基因位点（rs428253、rs4740、rs2243115、rs568408、rs582054 及rs583911）多态性与冠心病患者认知功能障碍发病风险相关。其原因可能包括：（1）认知功能障碍作为一种多因素疾病，单基因位点多态性可能通过影响蛋白质的转录及表达从而参与疾病的发生发展，但这些位点多位于启动子区或外显子区；与此同时，单个基因或者遗传变异对疾病发病风险的影响较小，难以用于人群的早期疾病筛查和风险预测，针对欧美人群的研究将与三酰甘油相关的3个基因共10个SNPs 及与低密度脂蛋白相关的3 个基因共10 个SNPs 等进行遗传风险评分，以此对SNPs 的累积效应进行分析，发现该评分与各血脂水平密切相关，并且其累积效应远大于单个SNP 与血脂的相关性，提示SNPs 的累积效应可增强遗传变异对相关疾病发病风险的评估和预测能力［24］。（2）基因-基因之间的协同作用和基因-环境交互作用在认知功能损伤发生发展中的重要性同样值得关注。研究发现，基因多态性与受教育水平之间的交互作用与认知功能损伤的风险存在显著相关［25］。（3）除此之外，Zhu等［6］关于IL-12A rs2243115及rs568408基因多态性与阿尔茨海默病关联性的研究主要针对中国北方汉族人群，而本研究则主要为中国南方人群，研究结果提示不同的人种和人群，其基因遗传背景存在差异，饮食习惯和生活方式也有所不同，因此对某些疾病的易感性也不尽相同。因此，深入探讨基因多态性、基因-基因、基因-环境交互作用已成为目前认知功能损伤分子流行病学以及病因学研究的另一重点，对阐明认知功能损伤发生发展的生物学机制具有重要意义。本研究虽然未发现IL-35 SNPs与冠心病患者认知功能障碍发生风险的相关性，但为将来对不同区域、不同遗传背景的人群制定不同重点的临床防治工作具有一定的意义。

本研究仍存在一定不足：（1）认知功能障碍作为一项慢性疾病，其发生发展是一个漫长的过程，基因及环境等因素对其发生发展的影响可能需要进一步长期随访加以明确。（2）目前仅对IL-35 基因6 个SNP位点进行探讨，在将来的研究中，应进一步增加研究位点，以明确IL-35 基因位点多态性与认知功能障碍的相关性，为进一步防治认知功能障碍提供理论依据。