孙洲 曹非 骆芳 向栩莹 晏桂林 陆观凤 杨燕泽 钟玉馨

(1华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科，湖北 武汉 430022；2湖北省中西医结合医院;3武汉市普爱医院神经内科)

过去对于缺血性脑卒中的治疗大多集中在神经保护方面，而忽视了缺血血管结构及功能重建可能带来的益处〔1,2〕。研究发现，梗塞交界区新生的血管周围逐渐出现神经干细胞的生长，二者在神经损伤后修复中出现同步现象，极可能是新生的血管为神经元提供血供和营养支持的结果〔3〕。研究发现尤瑞克林(HUK)促进血管新生可能通过上调抑制血管抑素表达〔4〕、升高碱性成纤维细胞生长因子〔5〕等机制。本实验从血管新生因子的角度进一步探讨HUK的脑保护机制。

1 材料和方法

1.1实验动物及分组 SD雄性大鼠采购于华中科技大学同济医学院实验动物供应中心，均在SPF级大鼠饲养室由专员饲养。大鼠缺血再灌注(I/R)造模成功后随机分为假手术(Sham)组(假手术+生理盐水)，模型(I/R+生理盐水)组、HUK低剂量(LDP)组(3.5×10-3PNAU/kg)、HUK中等剂量(MDP)组(8.75×10-3PNAU/kg)、HUK高剂量(HDP)组(17.5×10-3PNAU/kg)，均为尾静脉注射。每组选用5只成功雄性大鼠。

1.2I/R大脑中动脉梗塞模型制备 大鼠右侧局灶性大脑中动脉I/R模型采用改良后Zea Longa线栓方法〔6〕，于缺血2 h检测模型成功后拔出线栓，形成I/R。假手术组仅分离颈总动脉，充分游离颈外动脉、颈内动脉。本实验中动物处理方法符合动物伦理学标准。

1.3实验药物及制剂 实验用药为注射用HUK干粉针剂(凯力康)，购于广东天普生化医药股份有限公司，规格为0.15 PNAU/支。各组实验药物剂量设定均按实验动物HUK安全剂量换算，参照既往研究大鼠折算后用药剂量〔7〕。

1.4Western印迹测定磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-110α、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管生成素(Ang)-1蛋白表达 制备脑组织提取物，经电泳、转膜、脱脂牛奶封闭后，孵育一抗和二抗，最后显色曝光。蛋白印迹条带用Image J图像软件分析，测定各指标条带及内参条带的相对灰度值后分析数据，所得数据使用GraphPad软件进行绘图。

1.5统计学方法 运用SPSS16.0软件行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组PI3K-110α和eNOS表达比较 I/R 7 d，模型组与Sham组PI3K-1102、eNOS差异无统计学意义(P>0.05)；LDP组明显高于模型组(P<0.05)，HDP组明显高于MDP组(P<0.05)。见表1，图1。

表1 HUK上调I/R后7 d各组血管新生相关因子或受体表达比较

与模型组比较：1)P<0.05；与MDP组比较：2)P<0.05

图1 HUK上调I/R后7 d PI3K-110α和eNOS表达

2.2各组Ang-1和Ang受体(Tie)-2表达比较 I/R 7 d,与模型组比较，Sham组Ang-1和Tie-2表达差异无统计学意义(P>0.05)，LDP组能明显上调Ang-1蛋白表达(P<0.05)，MDP组与LDP组相比，Tie-2蛋白表达明显增高(P<0.05)。HDP组较MDP组能明显上调Ang-1蛋白水平及Tie-2表达水平(P<0.05)。见表1和图2。

图2 HUK上调I/R 7 d后Ang-1和Tie-2受体表达

2.3各组血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF受体(VEGFR)-2表达比较 I/R 7 d,模型组较Sham组VEGF表达水平显著升高(P<0.05)，VEGFR-2表达差异无统计学意义(P>0.05)；HDP组较 MDP组能明显上调VEGF表达(P<0.05)。MDP组较 LDP组VEGFR-2表达显著增高(P<0.01)；HDP组较MDP组显著上调VEGFR-2表达(P<0.01)。见表1和图3。

图3 HUK上调I/R 7 d后VEGF和VEGFR-2表达

3 讨 论

急性脑缺血后需及早开放病灶周围循环及促进血管新生，从而达到减少脑组织缺血、保护神经功能和改善临床预后的目的。促血管新生、改善循环涉及较多通路及机制，其中内皮祖细胞(EPCs)、成熟内皮细胞(ECs)激活、分化、增殖、迁移是血管出芽新生的重要过程已成为共识，本实验中各剂量HUK促进PI3K、eNOS上调，可能通过两条重要信号通路：PI3K/蛋白激酶B(Akt)/eNOS通路〔6〕和缓激肽受体B2(B2R)/PI3K/eNOS信号通路〔7〕促进血管扩张增加缺血区血流灌注，并促进EPCs和ECs迁移增加血管新生而起到神经保护作用。本研究提示，HUK在出芽新生血管稳定成熟期间也发挥了重要作用，且该作用大小呈HUK剂量效应关系。VEGF是血管新生最主要的因子之一，本研究HUK中、大剂量，尤其是大剂量可能通过PI3K-Akt-GSK-3β-VEGF-VEGFR-2途径上调VEGF及VEGFR-2促进再灌注后新生血管形成〔8,9〕。

综上，HUK可能通过多途径改善脑梗死灶循环，除促血管新生外，还可通过上调eNOS释放NO以扩张缺血区微血管，上调Tie-2等表达稳定新生血管从而发挥神经功能保护作用，且HUK的这些作用在一定程度上呈现出剂量-效应相关性。