罗镭 邵喜英

[摘要] 目的 建立并提升心无忧片的质量标准。 方法 采用薄层色谱法对心无忧片中的细辛、茵陈及丹参进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定心无忧片中丹酚酸B的含量。色谱柱为Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（25∶75），流速为1.0 mL/min，检测波长为286 nm，柱温为30℃。 结果 鉴别方法专属性强，定量方法简便、准确，丹酚酸B进样量在0.0735～3.6750 μg范围内线性关系良好，相关系数为1.0000;平均回收率为101.20%，RSD为1.05%。 结论 该方法简便、准确、重复性好，可作为心无忧片的质量标准。

[关键词] 心无忧片;薄层色谱法;高效液相色谱法;质量标准

[中图分类号] R927.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）07（a）-0029-05

Study on the improvement of quality standard of Xinwuyou Tablets

LUO Lei1   SHAO Xiying2

1.Department of Traditional Chinese Medicine， Zhejiang Institute for Food and Drug Control， Zhejiang Province， Hangzhou   310052， China; 2.Department of Medical Oncology， Zhejiang Cancer Hospital， Zhejiang Province， Hangzhou   310022， China

[Abstract] Objective To eastablish and improve the quality standard of Xinwuyou Tablets. Methods Thin-layer chromatography was used to identify Asari Radix et Rhizoma， Artemisiae Scopariae Herba and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma， and high performance liquid chromatography was applied for the determination of salvianolic acid B in Xinwuyou Tablets. Kromasil C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was adopted with a mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid （25∶75） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength wad set at 286 nm and the column tempetature was 30℃. Results The thin-layer chromatography identification was highly specific. The method of content determination was simple and accurate. The good linearity with peak areas was achieved in the range of 0.0735-3.6750 μg （r = 1.0000） for salvianolic acid B. The average recovery was 101.20% and the RSD was 1.05%. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the quality control of Xinwuyou Tablets.

[Key words] Xinwuyou Tablets; Thin-layer chromatography; High performance liquid chromatography; Quality standard

心无忧片是由黄杨木、细辛、丹参、川芎、茵陳、射干、土木香、瓜蒌皮八味中药组成的复方制剂，具有理气活血、宽胸止痛的功效，用于胸痹气滞血瘀症，症见胸痛、胸闷、心悸、气短、头昏、乏力等[1]。邵友凤[2]、李剑平等[3]用心无忧片治疗冠心病、心绞痛，结果显示能增加心肌供氧、扩张冠脉、改善冠脉血流量、增加心脏耐缺氧能力。闵旸等[4]通过抗冠状动脉血栓作用动物实验研究，发现心无忧片对狗冠脉结扎引起的心肌梗死有明显的治疗作用，对大鼠药物引起的心肌缺血有明显的预防作用，对动物实验性血栓形成和血小板聚集有明显的抑制作用。

心无忧片现行标准仅制订了丹参酮ⅡA的薄层鉴别[1]，质控项目少。检索心无忧片质量标准研究文献[5-7]，大部分为研究丹参酮ⅡA等脂溶性成分，而心无忧片生产工艺为水煎煮，脂溶性成分水煎煮得率低，不太适合作为心无忧片的含测指标。对方中其他药味的含测方法进行文献查阅[8-14]，大多还是以脂溶性成分为主。综合考量，最终选择丹参中水溶性成分丹酚酸B作为含测指标，参照文献[15-18]建立了心无忧片中丹酚酸B含测方法。近年来研究报道[19-21]，丹酚酸B能够抗心肌纤维化，对缺氧复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤具有保护作用。因此选择丹酚酸B作为含测指标，正好与心无忧片治疗冠心病、心绞痛的功效相呼应，对于心无忧片质量控制与标准的提升具有重要的意义。

心无忧片现行标准质控项目简单，为更好地控制产品质量，笔者对心无忧片质量标准进行了深化研究，建立了心无忧片中细辛、茵陈、丹参薄层色谱鉴别及丹酚酸B的高效液相色谱法（HPLC）含量测定方法，提升了质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AD型高效液相色谱仪（日本岛津公司）;XPE205十万分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;Elmasonic P型超声仪（德国Elma公司）;Milli-Q型纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药

心无忧片（批号20151201、20150301、20140601，杭州天目山药业股份有限公司）;对照品及对照药材：细辛（批号：121204-201606）、茵陈（批号：120950-201608）、丹参酮ⅡA（批号：110766-201520）、丹酚酸B（批号：111562-201615，含量以96.2%计）均来源于中国食品药品检定研究院。液相用甲醇为Merck公司色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 细辛

取心无忧片20片，除去糖衣，研细，粉末倒入圆底烧瓶中，加水约200 mL，圆底烧瓶放入电热套，烧瓶口接上挥发油提取器，提取器刻度部分加适量水，再加乙酸乙酯2 mL，开启电热套加热至微沸，煮沸约3 h，分取乙酸乙酯液，作为供试品溶液。称取细辛对照药材约0.5 g，按上述方法制备对照药材溶液。另按处方量制备除去细辛的心无忧片阴性样品，按上述方法制备心无忧片阴性供试品溶液。分别吸取上面3种样品溶液各10 μL，少量多次点于同一块硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4∶1）混合溶液作为展开剂，展开至约8 cm，取出，置通风柜吹干，喷以10%硫酸乙醇溶液显色剂，在105℃加热至斑点显色清晰，放置紫外光灯（365 nm）下拍照，结果见图1，心无忧片样品溶液与对照药材溶液均显示一个相同颜色的荧光主斑点，阴性样品溶液未显示该荧光主斑点，说明缺味无干扰。

2.1.2 茵陈

取心无忧片20片，除去糖衣，研细，粉末倒入50 mL具塞锥形瓶，加入70%甲醇30 mL，盖上塞子，用封口膜密封，置超声仪中超声处理20 min，放冷，滤纸过滤，滤液置水浴上蒸干，残渣加水10 mL溶解，溶液加于D101型大孔吸附树脂柱（内径为1.5 cm，柱高为15 cm），先用水100 mL冲洗，水洗液弃去，再用30%乙醇50 mL冲洗，收集冲洗液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。称取绿原酸对照品适量，加甲醇制备成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。另按处方量制备除去茵陈的阴性样品，按上述方法制备心无忧片阴性供试品溶液。分别吸取上述3种溶液各10 μL，少量多次点于同一聚酰胺薄膜板上，用醋酸作为展开剂，展开至8 cm，取出，置通风柜中吹干，再用氨蒸汽熏约3 min后，放置紫外光灯（365 nm）下拍照，结果见图2，在心无忧片样品溶液与对照品溶液显一个相同的荧光斑点，阴性样品溶液未显该荧光斑点，缺味无干扰。

2.1.3 丹参

取本品2 g，除去糖衣，研细，粉末倒入100 mL圆底烧瓶，加入20 mL乙醇，置水浴上加热回流1 h，过滤，滤液蒸干，残渣用乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。称取丹参酮ⅡA对照品适量，用乙醇制备成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。另按处方量制备除去丹参的阴性样品，按上述方法制备心无忧片阴性供试品溶液。分别吸取上述3种溶液各10 μL，少量多次点于同一硅胶G薄層板上，用石油醚（30～60℃）-三氯甲烷-乙酸乙酯（35∶5∶1）混合溶液作为展开剂，展开8 cm，取出，置通风柜中吹干，放置日光下拍照，结果见图3，心无忧片供试品显示与对照品相同颜色的斑点，缺味未显该红色斑点，表明缺味无干扰。

2.2 HPLC定量测定

2.2.1 色谱条件

Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;体积流量1.0 mL/min;流动相乙腈-0.1%磷酸溶液（25∶75）;检测波长286 nm;柱温30℃;进样量为10 μL。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 制备对照品溶液  精密称量丹酚酸B对照品19.10 mg，置50 mL量瓶中，用70%甲醇溶解并定容，摇匀，即得0.3675 mg/mL对照品储备液。精密吸取对照品储备液2 mL，置于10 mL量瓶中，用70%甲醇溶解并定容，得到0.0735 mg/mL对照品溶液。

2.2.2.2 制备供试品溶液  取心无忧片20片，除去糖衣，精密称定，用料理机打粉，精密称取粉末约0.5 g，倒入具塞锥形瓶里，精密量取70%甲醇25 mL加入具塞锥形瓶里，盖上塞子，用封口膜密封，称重，再置超声仪中超声30 min，放置室温，再称重，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，高速离心，取上清液作为供试品溶液。

2.2.2.3 制备阴性样品溶液  按处方配比（除去丹参）模拟制剂工艺，制备出缺少丹参的阴性样品，再按上述“2.2.2.2”项下方法，制备阴性样品溶液。

2.2.3 专属性考察

采用自动进样器依次吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL，打入高效液相色谱仪系统，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，测定结果见图4，供试品溶液呈现与对照品溶液一致的丹酚酸B色谱峰，阴性样品溶液未出现丹酚酸B的色谱峰，表明阴性对照无干扰，方法专属性良好。

2.2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.2.1”项下0.0735 mg/mL对照品溶液1、3、5、10 μL及0.3675 mg/mL对照品储备液3、5、10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积作为纵坐标（Y），以对照品进样量作为横坐标（X），制备标准曲线，得到线性回归方程为：Y = 658.35X- 2585.02（r = 1.0000），结果丹酚酸B进样量范围在0.0735～3.6750 μg内与其对应的峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.2.1”项下0.0735 mg/mL的丹酚酸B对照品溶液10 μL，连续进样6次测定丹酚酸B峰面积，结果丹酚酸B峰面积的RSD为0.24%，说明仪器进样偏差小、仪器精密度好。

2.2.6 重复性试验

取同一批号（批号：20151201）心无忧片样品6份，每份称取约0.5 g，精密称定，倒入具塞锥形瓶里，按照“2.2.2.2”项下步骤同法制备重复性用供试品溶液。按上述色谱条件进样测定，结果心无忧片中丹酚酸B的平均含量为3.243 mg/g，RSD为0.39%，表明供试品制备方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验

精密吸取同一份心无忧片供试品溶液，分别于0、3、9、18、24 h 进样测定丹酚酸B峰面积，计算各时间点丹酚酸B峰面积的RSD为0.23%，表明心无忧片供试品溶液中丹酚酸B成分在24 h内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验

采用加样回收法，称取已知含量的心无忧片样品（批号：20151201）6份，每份约0.25 g，精密称定，倒入置具塞锥形瓶里，分别加入丹酚酸B对照品溶液（0.3675 mg/mL）2 mL，精密量取70%甲醇23 mL加入具塞锥形瓶里，盖上塞子，按照“2.2.2.2”项下步骤同法制备回收率用供试品溶液。按上述色谱条件进样测定，计算回收率，结果心无忧片中丹酚酸B的平均回收率为100.01%，6份样品RSD为0.15%，表明方法回收率良好，結果见表1。

2.2.9 样品测定

对收集到的3批样品，按建立的含量测定方法进行测定，3批样品测定结果分别为1.07、1.82、1.09 mg/片。

3 讨论

3.1 细辛薄层色谱显色方法的选择

参考药典方法为香草醛硫酸显色后置日光下检测，结果斑点杂乱，缺味有干扰。后采用硫酸乙醇显色，置365 nm下检测，结果有一个亮黄色的特征性斑点，缺味无干扰。该薄层方法系首次开发实现，可用于细辛药材特征性薄层鉴别。

3.2 提取条件的选择

比较了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇不同提取溶剂，结果甲醇提取效率最低，30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇提取效率相当，30%甲醇样品溶液澄清度不如70%甲醇样品溶液，故最终选择70%甲醇作为提取溶剂。另外比较了超声和回流两种提取方法，无明显差异，考虑到超声提取更为简便，最终选择超声提取。

3.3 丹酚酸B溶液稳定性问题

实验比较发现，丹酚酸B对照品溶液光照后峰面积慢慢逐渐变小，采取避光措施后溶液稳定性良好，实验过程需注意避光操作。

[参考文献]

[1]  卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准（中药成方制剂）：第十三册[S].1997：46.

[2]  邵友凤.心无忧片治疗冠心病心绞痛42例[J].江西中医学院学报，2000，2（3）：18-19.

[3]  李剑平，范小芬.心无忧片治疗冠心病心绞痛40例观察——附复方丹参片治疗40例对照[J].浙江中医杂志，2001，36（5）：230.

[4]  闵旸，陆晴，钟雁，等.“心无忧片”抗冠状动脉血栓作用研究[C]//中国药理学会第九届制药工业药理学术会议论文摘要汇编，2000.

[5]  龚青.高效液相色谱法测定心无忧片中丹参酮ⅡA的含量[J].中国现代应用药学杂志，2003，20（7）：51-52.

[6]  满喜霞，黄占海.HPLC测定心无忧片中丹参酮ⅡA的含量[J].海峡药学，2010，22（7）：65-67.

[7]  孙辉，何胜利.HPLC法测定心无忧片中川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯、丹参素、丹酚酸B和丹参酮ⅡA[J].现代药物与临床，2018，33（3）：464-468.

[8]  梁军.HPLC测定川芎中5种药效成分的含量[J].解放军预防医学杂志，2015，33（2）：224-225.

[9]  尤献民，邹桂欣，邸子真，等.RP-HPLC同时测定射干9种活性成分含量[J].中国中医药信息杂志，2017，24（1）：82-86.

[10]  姜鸿，齐越，邹桂欣，等.甲基-β-环糊精手性流动相添加剂法拆分射干中异构体和结构相近化合物[J].中国现代应用药学，2017，34（1）：1-3.

[11]  袁园.HPLC法同时测定康妇软膏中异土木香内酯、土木香内酯、花椒毒酚、氧化前胡素、欧前胡素和蛇床子素[J].中国药师，2018，21（2）：339-344.

[12]  王韵，赵亮，柴逸峰，等.RP-HPLC法同时测定茵陈蒿汤中14个成分[J].药物分析杂志，2017，37（3）：393-401.

[13]  梁晓东，张茜，韦云，等.高效液相色谱法同时测定还脑益聪方中-细辛醚、-细辛醚和细辛醛的含量[J].山东中医杂志，2018，37（1）：67-70.

[14]  王辉俊，柯樱，叶冠.瓜蒌皮注射液中化学成分的UPLC/ESI-QTOF-MS分析[J].上海医药，2017，38（5）：60-65.

[15]  陈英红，周婷婷，王颖.反相高效液相色谱法测定妇炎舒胶囊中丹酚酸B的含量[J].中国医药导报，2016，13（6）：150-152.

[16]  程茜菲.高效液相色谱法同时测定丹参中6种化学成分的含量[J].西北药学杂志，2016，31（6）：551-554.

[17]  刘宴林，郑锦坤，徐晓梅.HPLC法测定复方丹七郁胶囊中丹酚酸B的含量[J].北方药学，2016，13（9）：2-3.

[18]  黎春彤，何世荣，刘皈阳，等.高效液相色谱法测定肾复康胶囊中丹酚酸B的含量[J].实用药物与临床，2016， 19（5）：617-619.

[19]  罗红，王春花，赵玲璐，等.丹酚酸B抗心肌纤维化的机制研究[J].中国药房，2017，28（28）：3900-3903.

[20]  黄海烽，王春花，赵玲璐，等.丹酚酸B抑制血管紧张素Ⅱ诱导心肌成纤维细胞增殖与分化的作用[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（13）：128-132.

[21]  刘莎莎，张赛，汤智，等.丹酚酸B对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用机制研究[J].湖南中医药大学学报，2017，37（8）：832-837.