李莉 王应霞 杨桂梅 尹健彬 张旋

[摘要] 目的 研究黃藤素对急性肺损伤（ALI）小鼠肺组织核因子-κB（NF-κB）表达和激活的影响。 方法 雄性SPF昆明小鼠60只按照抽签法随机分为6组（每组10只）：ALI组[气管滴入5 mg/kg脂多糖（LPS）]，正常对照组（假手术处理），阳性对照组（3.3 mg/kg氢化可的松注射液+ LPS），黄藤素低、中、高剂量组（2、10 mg/kg和50 mg/kg黄藤素注射液+LPS）。阳性药物和黄藤素均在模型建立前腹腔注射，1次/d，连续3 d。采用免疫组织化学法检测NF-κB p65蛋白在肺组织中的表达与定位。采用Western blot法检测磷酸化NF-κB p65蛋白的表达情况。 结果 与ALI组比较，黄藤素中、高剂量组小鼠肺组织中NF-κB p65蛋白进入细胞核的阳性细胞百分率明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。与ALI组比较，黄藤素低、中、高剂量组小鼠肺组织磷酸化NF-κB p65蛋白表达明显下调，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 黄藤素对LPS诱导的小鼠急性肺损伤具有防治作用，该作用与抑制NF-κB蛋白表达和激活有关。

[关键词] 黄藤素;急性肺损伤;脂多糖;核因子-κB;蛋白表达

[中图分类号] R563.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）07（a）-0007-04

Effect of Fibrauretin on the protein expression and activation of NF-κB in lung tissues of mice with acute lung injury

LI Li1   WANG Yingxia2   YANG Guimei3   YIN Jianbin3   ZHANG Xuan3

1.Biotherapy Center， the 3rd Affiliated Hospital of Kunming Medical University Tumor Hospital of Yunnan Province， Yunnan Province， Kunming   650106， China; 2.Department of Pathology， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Yunnan Province， Kunming   650032， China; 3.School of Pharmaceutical Sciences & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products， Kunming Medical University， Yunnan Province， Kunming   650500， China

[Abstract] Objective To study the effect of Fibrauretin on the protein expression and activation of nuclear factor kappa B （NF-κB） in lung tissues of mice with acute lung injury （ALI）. Methods Sixty male SPF Kunming mice were randomly divided into 6 groups by drawing lots （10 mice in each group）： ALI group [（intratracheal instillation of 5 mg/kg lipopolysaccharide （LPS）]， normal control group （sham operation）， positive control group （3.3 mg/kg Hydrocortisone Injection + LPS）， low， medium and high doses of Fibrauretin groups （2， 10 mg/kg and 50 mg/kg Fibrauretin Injection + LPS）. The positive drug and Fibrauretin were given by intraperitoneal injection once a day for 3 consecutive days before establishment of ALI model. Immunohistochemistry was used to detect the expression and localization of NF-κB p65 protein in lung tissues. Western blot was used to detect the expression of phosphorylated NF-κB p65 protein in lung tissues. Results Compared with ALI group， the percentage of positive cells with the entry of NF-κB p65 protein into the nucleus in lung tissues of mice in medium and high doses of Fibrauretin groups was decreased significantly， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Compared with ALI group， the protein expression of phosphorylated NF-κB p65 in lung tissues of mice in low， medium and high doses of Fibrauretin group was down-regulated significantly， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Fibrauretin has preventive effect on LPS-induced acute lung injury in mice， and the effect is related to the inhibition of the protein expression and activation of NF-κB.

[Key words] Fibrauretin; Acute lung injury; Lipopolysaccharide; NF-κB; Protein expression

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是一种临床常见危重病症，发展至严重阶段被称为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。ALI可由多种原因引起，如细菌感染、创伤、毒气吸入、机械通气等，其中细菌感染最多见[1-2]。ALI起病急、进展快，严重危及患者生命[3]。故ALI往往需要迅速及时治疗。然而，目前临床治疗措施和药物治疗效果并不理想，因此研发新型高效低毒的ALI防治药物非常必要。

黄藤素是我国研制的纯天然植物药，成分为盐酸巴马汀，具有抗菌、消炎、清热解毒等多种功效，因此被称为“植物抗生素”[4-6]。黄藤素临床主要用于各种炎症和感染性疾病，如妇科炎症、菌痢、肠炎、呼吸道及泌尿道感染等。本研究组前期研究发现，黄藤素能够明显减轻脂多糖致ALI小鼠肺组织炎性反应[7]。然而，黄藤素抗ALI的作用機制尚不清楚。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）是一类重要的核转录因子，参与免疫应答、炎性反应、组织损伤、肿瘤生长等多种过程[8-9]。NF-κB信号通路是重要的炎症信号通路，而ALI的本质是肺内失控性炎性反应。研究发现，NF-κB信号通路激活在ALI发病机制中起着重要作用[10-11]。因此，本研究旨在探讨黄藤素对ALI时肺组织NF-κB表达和激活的影响，初步阐明黄藤素抗ALI的机制。

1 材料与方法

1.1 主要药物与试剂

黄藤素注射液购自昆药集团股份有限公司，氢化可的松注射液购自百正药业股份有限公司;戊巴比妥钠购自Merk公司;脂多糖（O111：B4）购自Sigma公司;NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65多克隆抗体、GAPDH抗体购自Elabscience公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自TIANGEN公司;RIPA高效蛋白裂解液购自Solarbio公司;蛋白Marker购自Thermo公司。免疫组化试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验动物分组与处理

健康雄性SPF级昆明小鼠60只，体重18～22 g，购自昆明医科大学实验动物学部。在恒温、恒湿环境、明暗各12 h周期的饲养室常规喂养，实验前禁食12 h。按抽签法随机分为6组：ALI组（手术暴露气管，用微量注射器经气管滴入5 mg/kg脂多糖，随后将小鼠直立旋转2周），正常对照组（假手术处理），阳性对照组（3.3 mg/kg氢化可的松注射液+脂多糖），黄藤素低、中、高剂量组（2、10 mg/kg和50 mg/kg黄藤素注射液+脂多糖），每组10只。阳性药物和黄藤素均在模型建立前腹腔注射，1次/d，连续3 d。在气管滴入脂多糖后24 h处死小鼠，取出肺组织检测各项指标。ALI模型建立成功标准：组织结构上观察到肺泡腔明显缩小、部分肺泡塌陷，肺泡间隔增厚、炎症细胞浸润，NF-κB免疫组化染色细胞核染为棕色，表明炎症信号激活，发生急性肺部炎症。

1.3 免疫组织化学检测NF-κB表达和定位

常规制作病理切片;常规脱蜡、脱水;阻断灭活内源性过氧化物酶;微波抗原修复;血清工作液封闭，37℃ 10 min;滴加NF-κB p65一抗，4℃孵育过夜，PBS冲洗3×5 min;滴加生物素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3×5 min;滴加HRP标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗3×5 min;DAB染色，苏木精复染，常规脱水，透明，干燥，封片，显微镜下观察。阳性细胞判定标准：细胞核深染为棕褐色为阳性细胞，表明NF-κB激活进入细胞核。

1.4 Western blot法检测磷酸化NF-κB蛋白表达

常规提取蛋白;行SDS-PAGE电泳;常规转膜;进行免疫反应：用0.01 mol/L PBS洗膜，5 min×3次;加入包被液，室温2 h;弃包被液，0.01 mol/L PBS洗膜，5 min×3次;加入p-NF-κBp65一抗（4℃ 12 h）。弃一抗和1% mol/L BSA，0.01 mol/L PBS分别洗膜，5 min×3次;加入辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗，平稳摇动，室温2 h;弃二抗，0.01 mol/L PBS洗膜，5 min×3次;加入显色液;凝胶成像仪检测，使用Quantity One软件进行灰度测定，以GADPH为内参计算p-NF-κBp65蛋白相对表达量。

1.5统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄藤素对ALI小鼠肺组织NF-κB表达和定位的作用

与正常对照组比较，ALI组小鼠肺组织肺泡腔明显缩小、部分肺泡塌陷，肺泡间隔增厚，免疫组化染色显示肺组织细胞核被深染为棕色，表明NF-κB p65进入细胞核，NF-κB激活，肺内发生炎性反应。正常对照组小鼠肺组织结构正常，棕色着色浅，且主要分布于细胞浆，细胞核为蓝色，表明NF-κB未激活;与ALI组比较，阳性对照组、黄藤素中剂量和黄藤素高剂量组小鼠肺组织棕色着色较浅，细胞核棕染的细胞数量明显减少。阳性细胞计数发现，各组阳性细胞百分率均较正常对照组明显降低（P < 0.01）;阳性对照组、黄藤素中剂量组阳性细胞百分率低于ALI组（P < 0.05）;黄藤素中剂量和高剂量能够明显减少阳性细胞百分率，与ALI组和黄藤素低剂量组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）;黄藤素高剂量组阳性细胞百分率也明显低于正常对照组及阳性对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1～2。

A：ALI组;B：正常对照组;C：阳性对照组;D：黄藤素低剂量组;E：黄藤素中剂量组;F：黄藤素高剂量组。ALI：急性肺损伤;NF-κB：核因子-κB和核定位（免疫组化，100×）   与正常对照组比较，**P < 0.01;与ALI组比较，#P < 0.05;与阳性对照组比较，$P < 0.05;与低剂量组（黄藤素低剂量组）比较，&P < 0.05。ALI：急性肺损伤;NF-κB：核因子-κB

2.2 黄藤素抑制ALI小鼠肺组织磷酸化NF-κBp65蛋白表达

Western blot结果显示，ALI组、阳性对照组及黄藤素低、中高剂量组小鼠肺组织磷酸化NF-κB p65蛋白表达明显均上调，与正常对照组比较差异有统计学意义（P < 0.01）;与ALI组比较，黄藤素低、中、高剂量组小鼠肺组织磷酸化NF-κBp65蛋白表达明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）;与阳性对照组比较，黄藤素低、高剂量组小鼠肺组织磷酸化NF-κBp65蛋白表达明显下降，差异有统计学意义（P < 0.01），但黄藤素的剂量依赖关系不明显。见图3～4。

3 讨论

目前临床上ALI的主要治疗措施为保护性肺通气和应用糖皮质激素，然而疗效并不理想。研究发现，一些天然产物可以通过抑制炎症信号通路发挥抗ALI的作用，如姜黄素、人参皂苷Rg5、迷迭香酸、异佛司可林等[12]。本课题组前期研究发现，黄藤素能够明显抑制ALI小鼠肺内炎性反应，减轻肺损伤程度，但其抗急性肺损伤的机制尚不清楚[7]。

研究发现，NF-κB信号通路过度激活在ALI时炎症细胞因子过度释放中发挥重要作用[10-11]。各种引起ALI的因素均可激活NF-κB，启动下游多种炎症因子过度表达，导致ALI[13-14]。因此，NF-κB过度激活是ALI发病的关键环节，抑制NF-κB激活能够减轻ALI。黄藤素能否通过抑制NF-κB激活而减轻ALI呢？研究发现，黄藤素可通过抑制TRIF依赖的NF-κB信号通路而抑制子宫内膜上皮细胞炎性反应[15]。据此推测，黄藤素可能通过抑制NF-κB的激活从而发挥抗ALI作用。

NF-κB一般以二聚体（主要为p50/p65）形式存在于细胞浆中，未激活时与NF-κB抑制蛋白（IκB）结合，形成无活性复合体[16-18]。IκB有多种亚型，其中IκBα最重要，抑制NF-κB作用最强[19]。细胞外刺激信号可通过细胞膜受体传递到细胞内，IκB即被磷酸华，继而被泛素化，失去活性，释放出游离的NF-κB，NF-κB即被磷酸化激活，随后进入细胞核，启动靶基因表达[20-22]。因此，NF-κB进入细胞核是NF-κB激活的标志。本研究发现，与ALI组比较，黄藤素中剂量和高剂量组小鼠肺组织NF-κB p65蛋白进入细胞核的阳性细胞数量明显减少，表明黄藤素能够明显抑制NF-κB激活，有一定剂量依赖关系。

NF-κB磷酸化水平也可反映其激活情况，因此，本研究采用Western blot法检测了磷酸化NF-κB p65蛋白表达情况，发现ALI时肺组织磷酸化NF-κB p65蛋白表达明显上调，提示NF-κB被激活，而低、中、高剂量黄藤素均能下调肺组织磷酸化NF-κB p65蛋白表达，表明黄藤素能够抑制NF-κB信号通路激活，发挥抗ALI作用。本课题组前期研究发现黄藤素抑制ALI小鼠肺炎性反应有一定剂量依赖关系[7]。但本研究中黄藤素下调磷酸化NF-κB p65蛋白表达的剂量依赖关系不明显，其原因可能是Western blot法检测样本只是整个肺组织的一部分，气管滴入脂多糖在肺局部分布不均造成的。

综上所述，黄藤素能够明显下调ALI小鼠肺组织NF-κB表达，并抑制NF-κB磷酸化水平，从而抑制NF-κB信号通路激活，发挥抗ALI的作用。本研究初步发现了黄藤素抗ALI作用机制之一是抑制了肺内炎症相关NF-κB信号通路。

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