王静　韩彦龙　张书捷　王春涛　邓代千　孙凯　刘侠　王涛

【摘要】 目的：探究谷胱甘肽硫转移酶基因GSTM1基因多态性与东北地区汉族人群肺癌易感性的相关性及其临床应用创新。方法：选取2016年1月-2017年1月本院收治的肺癌患者中408例为研究组，选取同期健康体检人员303例为对照组，同组对象之间不存在血缘关系。以盐析法从支气管肺泡灌洗液或血凝块残留液中提取基因组DNA，采用PCR法及基于PCR基础上的限制性片段多態检测法（PCR-RFLP），对各基因型进行检验和区分。采用回顾性“病例-对照”试验设计，危险度计算采用非条件性逻辑斯谛回归模型（Unconditional logistic regression models）分别对年龄、性别进行校正后计算比数比（Odds Ratios，OR）及95%可信区间（Confidential Intervals，CI）。结果：研究组GSTM1缺陷型基因频率为0.61，对照组为0.44，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;GSTM1缺陷型与GSTM1功能型基因相比，缺陷型基因携带者患肺癌的危险升高2.084倍。结论：GSTM1缺陷型基因是导致东北地区汉族人群易感肺癌的主要因素，烟草致癌代谢活化是导致癌变的重要途径。

【关键词】 谷胱甘肽硫转移酶基因; 基因多态性; 东北地区; 汉族人群; 肺癌; 相关性; 应用创新

Association between Glutathione S-transferase Gene GSTM1 Gene Polymorphism and Lung Cancer Susceptibility of Han Population in Northeast China and Its Clinical Application Innovation/WANG Jing，HAN Yanlong，ZHANG Shujie，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（06）：00-004

【Abstract】 Objective：To explore the correlation between glutathione S-transferase gene GSTM1 gene polymorphism and lung cancer susceptibility of Han population in northeast China and its clinical application innovation.Method：A total of 408 lung cancer patients admitted to our hospital from January 2016 to January 2017 were selected as the study group， and 303 health check-ups in the same period were selected as the control group，there was no blood relationship among the subjects in the same group.Genomic DNA was extracted from bronchoalveolar lavage fluid or blood clot residue by salting out method.PCR and PCR-RFLP were used to detect and differentiate the genotypes.Using a retrospective "case-control" trial design，the risk degree was calculated by using unconditional logistic regression models to calculate odds ratios（OR）and 95% confidence intervals（95%CI）after adjusting for age and sex respectively.Result：The frequency of GSTM1-deficient gene in the study group was 0.61，and the control group was 0.44，the difference between two groups was statistically significant（P<0.05）.Compared with GSTM1 functional gene type，GSTM1 deficient gene carriers had a 2.084 times higher risk of lung cancer.

Conclusion：GSTM1 defective gene is the main factor that causes the Han population in northeast China to be susceptible to lung cancer，and the activation of carcinogenesis metabolism in tobacco is an important way to cause cancer.

【Key words】 Glutathione S-transferase gene; Gene polymorphism; Northeastern region; Han population; Lung cancer; Relevance; Applied innovation

First-authors address：School of Basic Medicine，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.06.001

肺癌作为恶性肿瘤之一，约占各类肿瘤发病的近20%，其死亡率更是高达30%。随着近年来我国人民生活水平的不断提高，肺癌的发生率逐年增加[1]。根据肿瘤流行病学研究显示吸烟与肺癌有密不可分的关系，习惯吸烟的人群患肺癌的概率为普通人群的20倍，由此可见吸烟与肺癌之间的关系密不可分。但是根据研究结果显示并非所有吸烟者均会患肺癌，这些吸烟者中只有一部分人患有肺癌，这是因为肺癌不止与烟草有关，还与个人对烟草致癌物的反应有关系，由此可以看出肺癌是由多种因素共同影响作用的，主要有外源性致癌物质进入机体内发生反应，DNA碱基发生缺少或添加导致DNA损伤、细胞的程序凋亡和死亡分化、机体免疫监控。以上均涉及基因多态的现象，这种成为基因多态的现象在外源性致癌物质在机体内的反应和DNA损伤中最为明显[2]。因为正常烟草致癌物进入人体后会被相关酶反应代谢清除掉，但是GSTM1基因表达缺陷将会干扰此过程的正常进行，如果外源性致癌物质不能从人体内代谢出去，将会引发吸烟者发生肺癌[3]。本文对该地区人群进行回顾性分析研究，分析GSTM1基因和肺癌癌变的关系以发现其在诊断肺癌方面的价值及临床创新，选取肺癌患者和不吸烟的健康人群为研究对象，比较两种类型的人群体内GSTM1基因多态性的表達情况。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月-2017年1月本院收治的肺癌患者中408例为研究组，同时选取同期健康体检人员303例为对照组，同组对象之间不存在血缘关系。纳入标准：经纤维支气管镜活检，为首次确诊病例。排除标准：严重肝肾功能疾病;其他类神经系统病症;其他恶性肿瘤病史者;近期内服用过免疫抑制剂患者;治疗期间生活、居住不在本地区的患者;合并有精神疾病或意识不清晰不能积极配合。所有研究对象均知情同意，并且经过医院伦理委员会批准。

1.2 方法 所有研究对象需要填写调查问卷，对于偏离实际调查情况的问卷予以排除，保证所有研究对象信息完整真实，包括吸烟史、饮酒史、家族史以及毒物接触情况[4]。

1.2.1 样本采集方法 研究组患者在肺癌病变的支气管口置入纤支镜，将接近人体正常体温的生理盐水50 mL注入后，采用负压的方法对其进行吸引，该过程需要重复两次，当回收的肺支气管肺泡灌洗液（BALF）含量达到35%即为合格。通过离心沉淀得到的细胞成分在同样条件下进行吸引冲洗，离心完成后摒弃上清液，加入Hanks液（生产厂家：北京索莱宝科技有限公司，型号：H1020）从而制备细胞悬液，并将制得的细胞悬液放入EP管中后再置于-70 ℃的低温下保存[5]。

对照组患者则抽取血清进行临床检验，将剩余的血冷凝保存在-70 ℃低温下即可。

1.2.2 DNA提取方法 将冷冻保存的标本取出后予以解冻，并取解冻后的血液1 000 μL置入RP管中，然后加入相同量的Tip头，通过3 000 r/min的离心速度进行离心，摒弃上清液[6]。该过程需要重复进行多次，当血样标本红色时证明离心不彻底还需继续操作，当沉淀的颜色呈淡红色时加入200 μL TE悬浮。最后使用70%乙醇吸水干燥。以0.7%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度仪检测所提DNA质量和浓度，见图1。

1.2.3 DNA鉴定方法 经上述步骤提取的DNA进行电泳，并对凝胶电泳的结果进行观察，使用100 ng/μL的蒸馏水溶解DNA后持续震荡，由此可以制备DNA模板，为下一步的PCR扩增做好准备[7]。

1.2.4 PCR扩增 将生成物离心后置入PCR扩增仪，采用琼脂糖凝胶电泳的方法对扩增的产物进行鉴定，将特异性内切酶防御恒温箱中进行消化，并通过凝胶电泳分析PCR扩增结果[8]。

1.2.5 PCR产物分析方法 将制备得到的胶板置入水平电泳槽，使用稀释的1×TAE液。吸取

2 μL扩增产物之后加样到琼脂糖凝胶电泳，同时加样阴性对照（未添加DNA模板）及阳性对照（稳定PCR产物）[9]。通电之后稳压在100 V，设定电泳的时间为10 min。电泳完成之后取出凝胶，在紫外灯下同Marker条带对比，从而确定扩增片段的长度，使用PCR-RFLP法实现GSTM1基因分型[10]。GSTM1基因多态性分析，引物序列：上游 5-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAGC-3，下游 5-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTGG-3;内对照引物（β-globin）：上游 5-CAA CTT CAT CCA CGT TCACC-3，下游 5-GAA GAG CCA AGG ACA GGTAC-3。结果判断：GSTM1基因存在，PCR反应将包含该重复序列的片段扩增出来，基因扩增片段长度为215 bp，β-globin是人白蛋白的基因标志，扩增片段长度为268 bp，在凝胶上显示两条相应大小的亮带，前方的是GSTM1条带，后面的是β-globin条带，记为F型基因;GSTM1基因缺陷，则无215 bp的GSTM1条带出现，仅有一条268 bp的β-globin条带，记为D型基因[11]。电泳结果，见图2。

1为阴性对照，M为DNA分子量标记。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用

字2检验。危险度计算采用非条件性逻辑斯谛回归模型（Unconditional logisticregression models）分别对年龄、性别进行校正后计算比数比（Odds Ratios，OR）及95%可信区间（Confidential Intervals，CI）。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组研究对象性别、年龄及吸烟史等资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。

2.2 两组GSTM1等位基因和各基因型的分布频率比较 研究组GSTM1缺陷型基因频率为0.61，对照组为0.44，两组比较差异有统计学意义（字2=4.291，P=0.029<0.05），见表2。

2.3 两组GSTM1基因型危险度分析 GSTM1缺陷型与GSTM1功能型基因相比，缺陷型基因携带者患肺癌的危险升高2.084倍，见表3。

3 讨论

谷胱甘肽硫转移酶属于催化酶，可以催化亲电子物质和GSH结合达到消毒DNA毒性的效果，而且两者结合生成的产物可以溶于水[12]。因此谷胱甘肽转移酶可以避免细胞受到促癌因素的影响，将机体内的微粒体过氧化过程阻断，并且对DNA损伤进行修复[13]。但是肺癌患者体内的GSTM1基因表达缺陷，与正常的基因不同，不能产生行使该功能的酶，因而无法阻断微粒体过氧化，也不能对DNA损伤进行修复，从而使肺癌的易感性增加[14]。

基因多态是指一个基因位点存在两个或两个以上的不同基因，它们之间成为等位基因。产生等位基因的原因有多种，主要包括单个碱基改变，DNA片段的插入或缺失，重复或序列发生变化，而且等位基因具有较高的发生频率，它们会影响基因产物的表達从而导致与肺癌之间的关联[15]。

烟草烟雾中的致癌物多达55种，最主要的是多环芳烃类和亚硝胺类，这些前致癌物进入体内经代谢活化酶活化后成为致癌物，进一步生成DNA加成产物导致DNA损伤;另一方面活化生成的致癌物还可通过代谢解毒酶降解排出[16-17]。两种酶的共同作用在个体间存在差异，由此导致个体肿瘤易感性的差异。因此致癌物能否引起个体癌变主要取决于两种酶之间的作用大小，由于编码该种酶基因的特性是遗传多样性，因此基因变异时会对酶造成影响，比如酶的功能、活性等，进一步影响酶激活或灭活目标底物的能力[18]。

而且肺癌在早期是不易被诊断出来的，当患者自身有所发现再检查时已经错过最佳手术机会，但是根据大量的研究结果显示肺癌患者的治疗效果与基因变异之间存在一定联系，所以借助于生物标志物来对肺癌患者的预后进行预测，这在一定程度上也是谷胱甘肽转移酶在临床上的应用创新[19]。

本文采用研究组与对照组的对比研究，不过两组研究对象均来自本院，受种族、地域、样本数量、环境以及个体差异等方面因素的影响，本研究只针对GSTM1、家族史、吸烟史等危险因素进行分析，存在一定的局限性。这是因为多个危险因素彼此之间可能会发生相互影响，从而生成不同的效果，所以GSTM1的基因多态性同肺癌的发病风险仍然需要深入研究[20]。研究组GSTM1缺陷型基因频率为0.61，对照组为0.44，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;GSTM1缺陷型与GSTM1功能型基因相比，缺陷型基因携带者患肺癌的危险升高2.084倍。

综上所述，GSTM1基因型在肺癌的发生中发挥了重要的作用，且GSTM1的基因多态性是肺癌风险因素。这就需要后续进行多位点、大样本研究，从而得到科学结果，从而为肺癌患者的早诊断、早治疗提供可靠的依据。

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