李思琦 李春雅 翁梦露 杨 悦 张健翔 刘 进 商 瑜 张晓嫣

（北京师范大学生命科学学院 北京 100875）

0 前言

“转染试剂Vigofect 对 HeLa 细胞转染的方案优化”是为生物学一年级研究生开设的细胞及组织培养课程中，学生做的开放实验课题。在学习了转染技术基本原理与操作、荧光显微镜成像技术、蛋白印迹技术后，学生综合运用以上技术，使用转染试剂，对HeLa 细胞的转染条件进行研究，分析影响转染效率的因素，探究转染条件的优化方案，以便为自己今后的实验工作提供借鉴。同时，这种问题导向性实验的设置，是为培养学生的创新性思维，改进研究生教学工作进行的探索。

转染是采用除病毒感染外的其他方法将外源核酸（DNA 或者 RNA）人工导入真核细胞的过程。通过转染能改变细胞内蛋白表达，改变细胞特性，是研究基因或其产物功能和调控机制的一种非常重要的技术手段［1］。将外源基因导入真核细胞的方法有很多种，例如：DEAE-葡聚糖转染法、磷酸钙转染法、脂质体法、显微注射法及电穿孔法等［2］。

目前常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们容易透过细胞膜，其中阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率。但由于阳离子脂质体易被血清清除，有高水平毒性，因此阳离子聚合物转染试剂被日益广泛地研发与使用。阳离子非脂质体转染试剂以阳离子聚合物为主要成分，其高度的分支结构确保了正离子电荷的高密度，使与带有负电荷的外源基因结合更有效，容易被细胞吸收，适合多种类型的细胞系，可广泛用于瞬时转染和稳定转染［3］。Vigofect 采用阳离子非脂性物质为主的配方，是一种高效真核转染试剂，可与 DNA 形成稳定的复合物，透过细胞膜进入细胞内，并保护 DNA 免受核酸酶的降解。

HeLa 细胞是现代生命科学研究中经常使用的一种细胞，是种源自一位美国妇女海莉耶塔·拉克斯（Henrietta Lacks）的子宫颈癌细胞的细胞系。HeLa 细胞是生物学研究中非常重要的实验材料，该细胞形态规则，生长速度较快，易于培养，且较易摄入外源质粒 DNA，是检测转染试剂效果的合宜材料。

转染过程中影响转染效率的因素包括：细胞状态、细胞密度、DNA 与转染试剂比例、转染前细胞培养时间、转染试剂孵育时间、培养液体积等。实验室将长期使用Vigofect 对Hela 细胞进行细胞转染，但转染流程沿用原有方法，未做过转染条件的优化，希望通过此次实验，能在质粒使用跟细胞转染时间上进行优化，既得到最大转染效率，又能节省试剂，更合理地安排实验时间。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料与试剂 人子宫颈癌细胞（HeLa，由北京师范大学生命科学学院商瑜实验室提供）、GFP 质粒、CHIP 过表达质粒（HA-CHIP）。

150 mmol／L NaCl（超纯水配制，高压或过滤灭菌）、Vigofect 转染试剂（威格拉斯）、牛奶（伊利脱脂奶粉配制）、Anti-CHIP（本实验室保存）、Anti-βactin（Sigma）、山羊抗小鼠 lgG／辣根酶标记（中杉金桥）、山羊抗兔 lgG／辣根酶标记（中杉金桥）、曝光试剂盒（显色底物，Thermo Scientific）、DMEM basic（gibco）、PBS（gibco）、胎牛血清 FBS（康源生物）。

1.2 实验仪器（表1）

表1 实验仪器及来源

1.3 实验步骤

1.3.1 细胞培养 将HeLa 细胞培养在含 10%胎牛血清的 DMEM 中（按 1∶1000 加入双抗），37℃，5% CO2培养箱中培养。

1.3.2 细胞转染及转染效率分析 转染前一天铺细胞于12 孔板，使细胞在转染当天达到指定汇合度（本实验中涉及汇合度为40%～100%）。

转染试剂为威格拉斯公司的Vigofect，根据该公司提供的产品说明步骤进行转染。

配制 Vigofect 工作液，1 μL Vigofect 加入 49 μL 150 mmol/L NaCl 溶液中。轻轻混匀，静置 5 min。工作体积每孔50 μL。

配制 DNA 工作液，工作体积为每孔50 μL。

将Vigofect 工作液分别逐滴加入DNA 工作液中，混匀后静置15 min。将混匀后的液体加入细胞培养体系中，轻轻混匀，置于 37℃，CO2培养箱中培养。

1.3.2.1 DNA 与转染试剂比例对转染效率的影响 转染前一天铺细胞于12 孔板，使细胞在转染当天达到汇合度70%。12 孔板中，固定Vigofect用量（1 μL），DNA 转染用量分别为 0.4 μg、1 μg、2.5 μg 和 6.25 μg。

1.3.2.2 细胞密度对转染效率的影响 12 孔板中，转染前一天调整铺入皿中的细胞数量，使细胞在转染当天分别达到40%、70%、100%的汇合度。固定 Vigofect 用量（1 μL），DNA 用量为 2.5 μg。

1.3.2.3 接种后培养时间对转染效率的影响分别在转染前16 h 及11 h 在12 孔板中铺入一定数量 HeLa 细胞，使两者细胞在转染当天分别达到 70%汇合度。固定 Vigofect 用量（1 μL），DNA用量为 2.5 μg。

以上转染操作均在转染试剂孵育5 h 后更换新鲜培养基。转染36 h 后观察细胞，用倒置荧光显微镜拍照，每孔细胞选取3 个视野，进行拍照，通过GFP 荧光表达量，判断细胞转染效率。利用Image J 软件统计转染效率。

1.3.3 Western Blot 检测

1.3.3.1 收集细胞样品 弃掉培养基，每个孔中加入 500 μL PBS，清洗细胞，每孔洗 2 遍。每孔中加入 200 μL 2×loading buffer，将细胞刮下，置于1.5 mL EP 管中，100℃煮 10 min，放入-20℃备用。

1.3.3.2 SDS-PAGE 凝胶电泳

1）清洗胶槽，组装。

2）按照表2 配制分离胶和浓缩胶。

表2 分离胶和浓缩胶的配制

取出制备好的样品上样量为10 μL，电泳仪设定为 140 V 恒压，30 min，160 V，1 h 30 min，至溴酚蓝跑出胶底边即可停止电泳。

1.3.3.3 转膜及丽春红染色 配制转膜缓冲液1 L：100 mL 10×transfer buffer（250 mmol／L Tris-HCl，192 mmol／L甘氨酸 ，ddH2O 中 加 入 30.2 g Tris-HCl，144 g 甘氨酸）+700 mL ddH2O+200 mL无水甲醇。

将PVD 膜置于甲醇中激活5 min。

制作“三明治”转膜结构：滤纸→胶→PVD 膜→滤纸按顺序叠放，在其表层轻轻加transfer buffer。将转膜装置放入冰水混合物中，转膜2 h。

转膜完毕后，将膜取出，浸泡在配制好的丽春红染色液（2%丽春红，30%三氯乙酸，30%磺基水杨酸）中，直至条带颜色完全显现出来，后转入清水中洗去浮色。

1.3.3.4 裁膜及封闭 裁下β-actin ［相对分子质量（Mr）≈4.3×104］作为内参，将要检测的蛋白放在膜的中心位置，将膜剪裁至合适大小并标记好所需抗体名称。放入清水中。

配 制 1 L TBST buffer：900 mL ddH2O 加 入100 mL 10×TBS （5 mol／L NaCl 275 mL，pH＝7.6 的Tris-HCl 100 mL 补齐至1 L）再加入1 mL 吐温。

配制封闭使用的牛奶（10%）：称 10 g 奶粉，加 TBST 至 100 mL，搅拌 5～10 min 至溶解。

将洗好的膜按照与封口垂直的方向放入自封袋中，加入配好的牛奶，没过膜，塑封机封住开口，37℃ 1 h 或 4℃过夜。

1.3.3.5 孵育一抗、二抗 用牛奶按照1∶1 000的比例配制一抗。封闭结束后，倒掉牛奶，加入一抗，封膜。4℃过夜或 37℃ 1～2 h。TBST 洗膜 4 遍，每遍5 min。

用 TBST 按照 1∶10 000 的比例配制二抗。将洗膜盒里的TBST 倒干净，直接在洗膜盒里加入适量二抗，37℃ 1 h 或者室温 2 h。TBST 洗膜 5遍，每遍 5 min。

1.3.3.6 曝光（化学发光仪） 将膜移入化学发光仪中。避光配制化学显影液。将显影液滴加到膜上，设置自动曝光参数（不显示 marker，曝光 15次），曝光结束后选择最合适曝光强度的照片，根据上样顺序按规范制作成实验结果图留存。

2 结果与讨论

2.1 DNA 与转染试剂比例对转染效率的影响DNA 转染用量为 0.4 μg、1 μg、2.5 μg 和 6.25 μg。实验结果显示，从表达GFP 细胞数目（图1、表1）和蛋白表达水平上看（图2），随着DNA 对转染试剂比例的增加，转染效率会逐渐提高，但超过一定限度，随着DNA 量的增加，转染效率不再提高。这也说明Vigofect 在转染时存在 DNA 转染量的限制，并不是转染的DNA 量越多转染效率越高。对于该实验体系，DNA 与 Vigofect 的最佳比例为1 μL Vigofect 转染 2.5 μg DNA。

图1 不同质粒转染量对转染效率的细胞水平观察

表1 不同质粒转染量条件下细胞荧光数量统计

图2 不同质粒转染量对转染效率的蛋白水平检测

2.2 细胞密度对转染效率的影响 实验室原有固定的转染流程都是在细胞汇合度达到70%时进行转染，因此预测此时转染效率应该最高。但出乎意料的是，实验结果提示细胞密度达到 40%时进行转染效率最高（图3、表2、图4）。经分析发现，实验室原有流程选择在70%细胞汇合度转染是为了削减转染试剂的细胞毒性作用，在保证细胞处于指数增长的前提下尽可能获得更多存活细胞。此次实验发现，对HeLa 细胞利用Vigofect 进行转染时，选用40%的细胞汇合度其转染效率更高：固定合适的转染试剂与质粒DNA 比例后，其细胞毒性比较小；40%的细胞汇合度，细胞状态更好，生长旺盛，摄取外源DNA 的能力也比较强。

图3 细胞密度对转染效率的影响的细胞水平观察

表2 不同细胞转染密度条件下细胞荧光数量统计

图4 细胞密度对转染效率的影响的蛋白水平检测

2.3 转染前细胞培养时间对转染效率的影响在孵育之前，通常选择较高密度接种细胞，在铺细胞后的16 h 进行转染，因为这样细胞能以比较好的状态贴壁生长且进入指数增长期，并通常都能达到常用的转染汇合度。但16 h 是否是最佳条件并未验证。

在本实验中为了探讨细胞接种后培养多长时间进行转染比较好，并能尽量缩短转染实验的时间，分别选择了16 h 后转染和11 h 后转染进行对比实验。分别于转染前 16 h 及11 h 在12 孔板中铺入相应数量HeLa 细胞，使细胞在进行转染时汇合度均达到 70%左右。固定 Vigofect 用量（1 μL），DNA 转染用量 2.5 μg。从实验结果来看，铺入细胞11 h 后进行转染的效率略高于16 h 转染的效率（图5、表3、图6）。

图5 转染时间对转染效率的影响的细胞水平观察

表3 不同转染时间条件下细胞荧光数量统计

图6 转染时间对转染效率的影响的蛋白水平检测

3 总结与评述

学生所在实验室经常会用转染技术研究基因和蛋白的功能及调控机制。实验室固有流程为细胞接种后16 h，细胞汇合度达到70%时，进行转染实验，转染质粒DNA 时倾向于增加用量，但为什么这样做，学生并不清楚。

本次探究实验针对固有流程，以HeLa 细胞为实验材料，通过调整转染过程中DNA 与转染试剂比例、转染前细胞培养时间、细胞密度等因素，比较不同条件下转染效率的变化，实现对细胞瞬时转染的条件优化的目的。通过之前测试确定，转染试剂孵育时间，以孵育4～6 h 换液转染效率最佳，因此不再考察。

通过这种探究性实验，学生发现细胞转染时不一定要按照实验室的原有经验，转染时细胞密度一定要达到70%，转染一定要等接种后16 h。可适当降低细胞密度，适当提前转染时间，选择合适的转染试剂与质粒DNA 的比例。本实验中用Vigofect 转染HeLa 细胞时最优条件为以合适密度接种细胞后培养11 h 进行转染，转染时细胞汇合度在 40%～50%，每孔的质粒用量为 2.5 μg。既节省了时间、试剂，还提高了转染效率。

通过本次的探究性实验，学生体会到方法不是一成不变的，需要不断探索和优化。在繁忙的科研活动中，偶尔做一次简单的方法优化小实验，不仅可帮助提高科研效率，而且也为科研生活增添了乐趣。