王嘉睿 李苏华 罗艳婷 黄卓山 彭隆 赵云跃 刘金来

【关键词】 糖尿病心肌病;人参皂苷Rb1;沉默信息调节因子2相关酶1;细胞凋亡;

炎症反应

Role of SIRT1/NF-κB pathway in the effect of ginsenoside Rb1 on apoptosis and inflammation of H9C2 cells treated with high glucose Wang Jiarui， Li Suhua， Luo Yanting， Huang Zhuoshan， Peng Long， Zhao Yunyue， Liu Jinlai. Department of Cardiology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， 510630 Guangzhou， China

Corresponding author， Liu Jinlai， E-mail： liujinl@ hotmail. com

【Abstract】 Objective To investigate the role of silent information regulation 2 homolog 1 （SIRT1）/NF-κB pathway in the effect of ginsenoside Rb1 upon the apoptosis and inflammation of H9C2 cells treated with high glucose.  Methods The H9C2 cells were cultured in high glucose medium （33 μmol/L） and co-treated with different concentrations of ginsenoside Rb1. The cell viability was detected by CCK-8 assay. The concentrations of TNF-α and IL-6 in the cellular supernatant were measured by ELISA. The optimal treatment concentration of ginsenoside Rb1 for the high glucose-treated H9C2 cells was determined. SIRT1 gene was silenced by siRNA transfection. The expression levels of Bax， bcl-2， cleaved caspase-3， SIRT1 and NF-κB proteins were quantitatively detected by Western blot. The content of TNF-α and IL-6 in the cellular supernatant was measured by ELISA to determine whether ginsenoside Rb1 could alleviate the apoptosis and inflammation of H9C2 cells through SIRT1/NF-κB pathway.  Results CCK8 assay demonstrated that the viability of H9C2 cells began to significantly decline when treated with 33 μmol/L glucose （P < 0.05）. The viability of H9C2 cells co-treated with 33 μmol/L glucose and 50μmol/L ginsenoside Rb1 had the highest cell viability （P < 0.05）. ELISA revealed that the concentrations of TNF-α （P < 0.05） and IL-6 （P < 0.05） were the lowest when the cells were co-treated with 50 μmol/L ginsenoside Rb1. The acetylation level of NF-κB significantly differed between the ginsenoside Rb1 and high glucose treatment groups （P < 0.05）. The expression levels of Bax/Bcl-2 and Acetyl-NF-κB/NF-κB did not significantly differ between the siRNA transfection plus ginsenoside Rb1 treatment group and siRNA transfection plus high glucose treatment groups （both P > 0.05）. The content of TNF-α and IL-6 did not significantly differ （both P > 0.05）.  Conclusion Ginsenoside Rb1 can protect the H9C2 cells with high glucose treatment from apoptosis and inflammation via regulating the Sirt1/NF-κB pathway.

【Key words】 Diabetic cardiomyopathy;Ginsenoside Rb1;Silent information regulation 2 homolog 1;

Apoptosis;Inflammation

糖尿病心肌病（DCM）是一类无冠状动脉疾病、高血压病以及瓣膜疾病的糖尿病患者出现左室射血时间缩短，充盈末期心室压力升高，左室壁僵硬，心收缩力减弱，以及等容舒张时间延长等一系列异常表现的心肌疾病[1-2]。其发病机制未被完全阐明，炎症反应与细胞凋亡被认为是其重要的发病机制[3-4]。人参皂苷Rb1是人参的重要活性成分，在清除自由基、抗氧化、改善认知和延缓衰老方面发挥重要作用，有研究证实其可降低DCM大鼠心肌超微结构损伤并改善其血脂、血糖及心肌氧化应激水平[5-6]。另有研究发现人参皂苷 Rb1抗衰老的作用与上调沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）相关，人参皂苷 Rb1还可通过抑制NF-κBp65介导的氧化应激和炎症反应延缓复制性内皮细胞衰老[7]。SIRT1是一种高度保守依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶，研究表明在人卵巢颗粒细胞中通过激活SIRT1可以起到减轻凋亡与抗炎的作用[8-9]。本实验拟观察人参皂苷Rb1对高糖处理下大鼠胚胎心源性干细胞H9C2细胞的最佳保护浓度，并从SIRT1/NF-κB通路探讨人参皂苷Rb1对高糖处理下H9C2细胞凋亡与炎症反应作用的机制。

材料与方法

一、材 料

H9C2细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。细胞培养用DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司。人参皂苷Rb1购自成都普菲得生物技术有限公司。 SIRT1 siRNA，阴性对照序列购自苏州吉玛基因股份有限公司。Lipofetamine@ RNA-iMaX与Opti-MEM I购自Thermo-Fisher公司。CCK-8试剂盒购自东仁化学科技（上海）有限公司。TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。细胞裂解液购自新海基因公司，蛋白酶抑制剂购自MedChemExpress，HRP标记的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗购自博士德生物。兔抗大鼠核因子-κB（NF-κB）、acetylated-NF-κB、cleaved caspase-3、GAPDH一抗、小鼠抗大鼠SIRT1一抗购自Cell Signaling Technology。兔抗大鼠Bax、Bcl-2一抗购自博士德生物。

二、方 法

1. 细胞培养及分组

H9C2细胞培养于含有10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养基中。细胞培养至80%融合后，消化并细胞计数按8×105/孔的数量传代至6孔板中。在探讨人参皂苷Rb1对H9C2细胞在高糖环境下起保护的最佳浓度时：将细胞分为对照组、20 μmol/L Rb1组、50 μmol/L Rb1组、100 μmol/L

Rb1组、120 μmol/L Rb1组、200 μmol/L Rb1组，将不同浓度的药物加入细胞培养液中培养48 h。在探讨人参皂苷Rb1是否通过SIRT1/ NF-κB通路减轻H9C2细胞凋亡与炎症反应机制时，分为6组：正常糖（5.5 mmol/L）组、高糖（33 mmol/L）组、高糖+人参皂苷Rb1组、高糖+DMSO组、高糖+SIRT1 siRNA组、高糖+SIRT1 siRNA组+Rb1组，将不同处理加入细胞培养液中培养48 h。

2. RNA干扰

SIRT1 siRNA序列（正义链为5’-GGCAGUU-

AAUGAAGCUAUATT-3’，反义链为5’-UAUAGCU-UCAUUAACUGCCTT-3’）、阴性对照序列（正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反义链为

5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’）用DEPC水配成20 μmol/L的浓度分装保存于-20℃。转染前1 d，2 ml无血清无抗生素培养基接种5×105个H9C2细胞，转染时细胞密度60%。每孔用50 μl Opti-MEMI培养基稀释3 μl Lipofectamine@RNA-iMax转染试剂，另每孔用50 μl Opti-MEMI培养基稀释

5 μl siRNA，各混匀后室温放置5 min，将稀释好的siRNA及转染试剂溶液混合，室温静置10～15 min，将混合液加入6孔板中，充分混匀，置入37℃，5%CO2培养箱培养6 h后，更换新鲜培养基，再转移入培养箱继续培养24 h。

3. 细胞活力检测

将H9C2细胞接种于96孔板中，每孔3 000个细胞，每个处理因素设3个复孔。细胞贴壁后进行处理，探索培养基糖浓度时设置5个组：对照组、33 μmol/L葡萄糖组、44 μmol/L葡萄糖组、55 μmol/L葡萄糖组、5.5 μmol/L葡萄糖+27.5 μmol/L甘露醇组（Mannitol）。设置7个组：调零组、对照组、高糖组、高糖+20 μmol/L Rb1组、高糖+50 μmol/L Rb1组、高糖+100 μmol/L Rb1组、高糖+200 μmol/L Rb1组。作用48 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂，放入37℃温箱避光培养2.5 h。最后用酶标仪读取各孔在450 nm的吸光度值（OD）。 细胞存活率计算公式=（实验孔-空白孔）/（对照孔-空白孔）×100%。

4.蛋白免疫印迹法

细胞蛋白提取方法按照南京凯基生物有限公司全蛋白提取试剂盒说明书执行。随后按上海生工生物工程技术公司BCA蛋白定量试剂盒说明书测定蛋白量。经BCA定量后，取30 μg總蛋白进行

SDS-PAGE电泳，然后转移到PVDF膜上。用5%BSA室温封闭1 h后，加入相应抗体（SIRT1 1∶3 000，NF-κB 1∶3 000，acetylated-NF-κB 1∶1 000，cleaved-caspased 1∶1 000， Bax 1∶3 000、Bcl-2 1∶3 000），4℃摇床过夜孵育洗膜;然后用二抗室温孵育1 h，在暗室中用增强化学发光检测试剂显色，拍片晾干，计算机扫描，采用Image J软件分析蛋白条带。目的蛋白相对表达量=目的蛋白OD/内参照。

5. TNF-α、IL-6含量检测

细胞培养液上清液中TNF-α、IL-6的含量按照ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书步骤检测。

三、统计学处理

采用Graphpad Prism 7.0.4进行分析，计量资料以表示，组间均数比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同葡萄糖浓度对H9C2细胞活性的影响

用CCK8法测定不同糖浓度高糖培养基里H9C2细胞的活性，得出33 μmol/L及以上糖浓度处理下的H9C2细胞已经有细胞活性的降低，并与对照组比较差异有统计学意义（F=5.123， P <

0.05;33 μmol/L组 vs.对照组P = 0.008，44 μmol/L

vs.对照组P = 0.010，55 μmol/L组 vs. 对照组P = 0.004），见图1A，故选定33 μmol/L为本次实验的处理浓度。

二、不同浓度人参皂苷Rb1对高糖处理下H9C2细胞活性的影响

用CCK8法测定33 μmol/L高糖培养基里不同人参皂苷Rb1浓度处理的细胞活性，得出50 μmol/L的人参皂苷Rb1与高糖共处理下的细胞活性最高，并与高糖组比较差异有统计学意义（F = 57.33， P < 0.05;高糖组vs. 对照组P < 0.001，高糖组vs.高糖+50 μmol/L Rb1组P = 0.004），见图1B。

三、不同浓度人参皂苷Rb1对高糖处理下H9C2细胞分泌TNF-α、IL-6水平的影响

ELISA测定细胞上清液中的TNF-α与IL-6分泌蛋白量，可见人参皂苷Rb1 浓度为50 μmol/L时候的TNF-α与IL-6在各个浓度组中最低，分别为（386.1±19.42） pg/ml与（23.05±1.29） pg/ml，

与高糖组比较差异均有统计学意义（TNF-α：F = 16.42， P < 0.05，高糖组vs.对照组P < 0.001，高糖组vs.高糖+50 μmol/L Rb1组P < 0.001;IL-6：F = 8.375，P < 0.05，高糖组vs.对照组P = 0.018，高糖组vs.高糖+50 μmol/L Rb1组P = 0.008），见图2。

四、不同浓度人参皂苷Rb1对高糖处理下H9C2细胞Bax/Bcl-2、cleaved caspase 3的含量的影响

蛋白免疫印迹法结果显示，50 μmol/L的人参皂苷Rb1处理时Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3的含量与高糖组比较差异均有统计学上意义（Bax/Bcl-2： F = 14.17， P < 0.05，高糖组vs.对照组P = 0.047，高糖组vs.高糖+50 μmol/L Rb1组P < 0.001。cleaved caspase-3： F = 15.47， P < 0.05;高糖组vs.对照组P = 0.001，高糖组vs.高糖+50 μmol/L Rb1组P = 0.012），较其他浓度平均值最低，见图3。综上，故选择50 μmol/L作为后续高糖状态下人参皂苷Rb1干预的浓度。

五、 SIRT1的siRNA干扰后人参皂苷Rb1对高糖处理下H9C2细胞的SIRT1、Bax、Bcl-2、NF-κB，Acetyl-NF-κB蛋白表达量影响

与SIRT1 siRNA组相比，SIRT1 siRNA+Rb1组

SIRT1（F = 700， P < 0.05;SIRT1 siRNA组vs. SIRT1 siRNA+Rb1组P = 0.107）、Bax/Bcl-2（F = 187， P < 0.05;SIRT1 siRNA组vs. SIRT1 siRNA

+Rb1组P = 0.867）、acetyl-NF-κB/NF-κB（F = 458， P < 0.05;SIRT1 siRNA组vs. SIRT1 siRNA+Rb1组P = 0.079）蛋白表达水平相当，高糖 +Rb1组SIRT1表达量更高（高糖+Rb1组vs. SIRT1 siRNA组P < 0.001），Bax/Bcl-2与Acetyl-NF-κB/NF-κB更低（P均< 0.001），见图4。

六、SIRT1的siRNA干扰后人参皂苷Rb1对高糖处理下H9C2细胞上清液TNF-α，IL-6浓度测定

SIRT1 siRNA组与SIRT1 siRNA+Rb1组TNF-α（F = 208， P < 0.05;SIRT1 siRNA组vs. SIRT1

siRNA+Rb1组P = 0.274）、IL-6（F = 61.68，P < 0.05; SIRT1 siRNA组vs SIRT1 siRNA+Rb1组P = 0.9677）浓度比较差异均无统计学意义，高糖+Rb1组TNF-α、IL-6浓度则低于SIRT1 siRNA组（P均< 0.001），见图5。

讨 论

本研究显示，高糖组 H9C2 心肌细胞的活性下降，而 50 μmol/L的人参皂苷Rb1显著增加了高糖培养的 H9C2 心肌细胞的活性，提示人参皂苷Rb1对 H9C2 心肌细胞的活力有保护作用。

SIRT1在原核和真核细胞中都能调节重要的代谢通道，与细胞存活、衰老、增殖、凋亡、DNA修复、细胞代谢与能量限制等重要的生命活动相关[10]。心肌细胞凋亡过度是糖尿病心肌病发生的重要病理学变化，受到多种凋亡蛋白的调控[3]。Caspase-3是细胞凋亡的关键执行者，其在正常情况下以无活性的酶原存在，而它的活化需要水解为p12与p17两个活性片段以促进细胞凋亡的发生[11]。Bax是Bcl-2蛋白家族的成员，其表达上调后发挥促凋亡作用，而在各种凋亡刺激下，Bcl-2 通過抑制线粒体细胞色素C的释放而发挥存活功能，二者的比值可以一定程度上表示细胞的凋亡水平[12-13]。本研究构建了心肌细胞在高糖处理下模型，发现高糖处理中心肌细胞表达cleaved caspase-3。Bax/Bcl-2显著升高，而以50 μmol/L的人参皂苷Rb1处理后可显著降低上述凋亡相关蛋白的表达，起到减轻凋亡的作用。通过siRNA干扰技术下调SIRT1表达后发现，下调SIRT1的心肌细胞在高糖环境中表达的Bax/Bcl-2比值显著升高，且加用人参皂苷Rb1的处理后无显著差异，SIRT1的下调抵消了人参皂苷Rb1抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡的作用。

心肌细胞过度凋亡之外，炎症也是糖尿病心肌病发病的重要机制，TNF-α、IL-6等细胞因子可以促进类似于瀑布式的炎症反应，造成心肌组织损伤[14]。本研究表明，高糖处理后心肌细胞分泌的TNF-α、IL-6水平显著升高，而加用50 μmol/L

人参皂苷Rb1处理后可以显著降低上清细胞分泌的TNF-α、IL-6，减少炎症因子的释放。下调SIRT1后可抵消人参皂苷Rb1使TNF-α、IL-6下降的作用，人参皂苷Rb1可通过上调SIRT1降低TNF-α、IL-6的分泌。

NF-κB是一个广泛存在的同源或异源二聚体转录因子，它可以调控细胞存活、分化与增殖，参与机体防御、组织损伤、应激及炎症过程中相关基因表达调控[15]。SIRT1的激活能够对NF-κBp65的K310与组蛋白3的K9发挥去乙酰化作用，导致NF-κBp65与DNA之间的连接减少，继而下调还原型辅酶Ⅱ的氧化应激亚单位（NOX1和NOX2）的转录，实现减轻心肌肥厚和下调氧化应激[16]。本研究显示在高糖环境下的心肌细胞加用50 μmol/L人参皂苷Rb1处理之后显著下调了NF-κB的乙酰化水平（acetyl-NF-κB/NF-κB），而用siRNA下调SIRT1表达后NF-κB的乙酰化水平显著升高，再加用人参皂苷Rb1对NF-κB的乙酰化水平没有显著改变，表明NF-κB的乙酰化以及其下游反应可由SIRT1介导。

综上所述，人参皂苷Rb1可通过SIRT1/NF-κB通路减轻细胞凋亡与炎症反应，推测其对糖尿病心肌病有保护作用。作用于SIRT1/NF-κB通路的药物可能是临床上糖尿病心肌病的治疗方法之一。

参 考 文 献

[1] Rubler S， Dlugash J， Yuceoglu YZ， Kumral T， Branwood AW， Grishman A. New type of cardiomyopathy associated with diabetic glomerulosclerosis. Am J Cardiol， 1972， 30（6）： 595-602.

[2] Shapiro LM. Echocardiographic features of impaired ventricular function in diabetes mellitus. Br Heart J， 1982， 47（5）： 439-444.

[3] Bugger H， Abel ED. Molecular mechanisms of diabetic cardiomyopathy. Diabetologia， 2014， 57（4）： 660-671.

[4] 王嘉睿，吴永祥，刘金来. AMPK/SIRT1/NF-κB通路在糖尿病心肌病中的作用. 新医学， 2017， 48（10）： 677-682.

[5] Cheng Y， Shen LH， Zhang JT. Anti-amnestic and anti-aging effects of ginsenoside Rg1 and Rb1 and its mechanism of action. Acta Pharmacol Sin， 2005， 26（2）： 143-149.

[6] 谷金寧， 牛俊， 皮子凤， 越皓，吴绥生，刘淑莹. 尿液代谢组学方法研究人参总皂苷治疗糖尿病心肌病大鼠作用机制. 分析化学， 2013， 41（3） ： 371-376.

[7] 周彬，吴琳，凌叶盛，余舒杰，刘定辉，柯世业，刘勇，郝宝顺，钱孝贤.人参皂苷Rb1通过抑制NF-κB p65介导的炎症和氧化应激改善内皮细胞复制性衰老. 中山大学学报（医学科学版），2018，39（6）：835-843.

[8] Finkel T， Deng CX， Mostoslavsky R. Recent progress in the biology and physiology of sirtuins. Nature， 2009， 460（7255）：587-591.

[9] Han Y ， Luo H ， Wang H ， Cai J， Zhang Y. SIRT1 induces resistance to apoptosis in human granulosa cells by activating the ERK pathway and inhibiting NF-κB signaling with anti-inflammatory functions. Apoptosis， 2017，22（10）：1260-1272.

[10] Carafa V， Rotili D， Forgione M， Cuomo F， Serretiello E， Hailu GS， Jarho E， Lahtela-Kakkonen M， Mai A， Altucci L. Sirtuin functions and modulation： from chemistry to the clinic. Clin Epigenetic， 2016，8：61.

[11] Nicholson DW， Ali A， Thornberry NA， Vaillancourt JP， Ding CK， Gallant M， Gareau Y， Griffin PR， Labelle M， Lazebnik YA. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature，1995，376（6535）：37-43.

[12] Wei MC， Zong WX， Cheng EH， Lindsten T， Panoutsakopoulou V， Ross AJ， Roth KA， MacGregor GR， Thompson CB， Korsme-yer SJ. Proapoptotic BAX and BAK： a requisite gateway to

mitochondrial dysfunction and death. Science，2001，292 （5517）：727-730.

[13] Murphy KM， Ranganathan V， Farnsworth ML，Kavallaris M， Lock RB. Bcl-2 inhibits Bax translocation from cytosol to mitochondria during drug-induced apoptosis of human tumor cells. Cell Death Differ，2000，7（1）：102-111.

[14] Lin L， Wu XD， Davey AK， Wang J.The anti-inflammatory effect of baicalin on hypoxia/reoxygenation and TNF-αinduced injury in cultural rat cardiomyocytes. Phytother Res， 2010， 24（3）：429-437.

[15] Zhang Q， Lenardo MJ， Baltimore D. 30 years of NF-κB： a blos-soming of relevance to human pathobiology. Cell， 2017， 168（1-2）：37-57.

[16] Bagul PK， Deepthi N， Sultana R， Banerjee SK. Resveratrol ameliorates cardiac oxidative stress in diabetes through deacety-lation of NFκB-p65 and histone 3. J Nutr Biochem， 2015， 26（11）： 1298-1307.

（收稿日期：2019-01-18）

（本文編辑：杨江瑜）