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葡萄籽提取物对高糖诱导系膜细胞肥大的抑制研究

2016-07-26郑欣

中国实用医药 2016年17期
关键词:高糖

郑欣

【摘要】 目的 探究葡萄籽提取物(GSE)对高糖诱导系膜细胞肥大的抑制作用。方法 将大鼠系细胞膜分为常规组(NG组)、高糖组(HG组)和高糖联合GSE(高、中、低)组, 对蛋白/细胞数量比值、细胞增殖、细胞周期变化和P21与P27表达情况进行分析。结果 将NG组为比较对象, 其他组在系膜通过高糖连续性培养2 d 后, 蛋白/细胞数呈现出上升趋势, HG联合中剂量GSE组和HG联合大剂量组的细胞蛋白/细胞数比值呈现出下降趋势, 差异有统计学意义(P<0.05)。将NG组为比较对象, 其他组经高糖培养48、72 h后, 系膜细胞的增值水平减弱, HG联合中剂量GSE组和HG联合大剂量组明显高于HG组, 差异有统计学意义(P<0.05)。系膜细胞经过D-葡糖连续刺激2 d后, 两种物质的蛋白质水平显著提升, 差异有统计学意义(P<0.05)。经高糖联合GSE处理后, 以单独高糖组为研究对象, 证明GSE可全面对P21和P27起到抑制上升, 浓度存在依赖性, 差异有统计学意义(P<0.05)。系细胞膜经过高糖连续刺激48 h后, 细胞G0/G1期的比例显著上升, 和S期相比显著减少, 差异有统计学意义(P<0.05)。HG联合中量GSE组和HG联合高粱GSE组细胞的G0/G1比例下降, S期细胞明显提升, 差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GSE可全面抑制高糖诱导系细胞膜肥大, 证明该物质能够全面缓解DN的疾病进展。

【关键词】 高糖;系膜细胞肥大;葡萄籽提取物

DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.17.195

糖尿病肾病(DN)发病机制较为复杂, 值得说明的是, 对1型和2型糖尿病患者的肾脏组织标本实施形态学分析可见, DN细胞在表型转化先期主要特征为细胞异常肥大[1], 其中又以系膜细胞肥大最为显著, 且在DN病理后期和系细胞膜肥大之间存在关联性。对高糖诱导系细胞膜肥大进行全面干预, 对于先期干预DN疾病进展、延长DN患者的生存时间有着非常重要的现实意义。GSE有着差异化生物活性, 有相关研究证实, 对于糖尿病大鼠使用一定剂量的GSE, 可提升肾脏功能水平。出现这种情况的原因和减少糖尿病小鼠糖基化参数、肾组织生长因子和提升肾脏抗氧化水平密切相关, 且当前鲜有文献对葡萄籽提取物对DN的分子和细胞作用加以阐述。为了全面探究葡萄籽提取物对高糖诱导系膜细胞肥大的抑制情况, 本文联系实际, 对该命题进行全面研究, 重点在于分析其作用分子机制, 现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 原青花素含量≥95%的 GSE, 大鼠系膜细胞, RIPM1640培养基, 胎牛血清(FBS), D-葡糖, 兔来源抗P21CIP和P27KIP。

1. 2 方法 在培养液内加入青霉素, 浓度为10%的 FBS溶液, 链霉素溶液, 剂量均为100 U/ml, 将大鼠系膜细胞放置于上述培养液中, 混合完毕后, 将样本放在37℃, 5%体积分数二氧化碳饱和湿度培养箱。在细胞出现单层贴壁生长后, 每2天实施传代1次, 选择对数生长期细胞作为本实验原料。

1. 2. 1 分组原则 选择适当密度对系膜细胞转种, 在进行实验以前, 使用FBS培养液1640进行同步培养, 在16 h后, 加入剂量不相同的GSE在FBS培养液中继续培养48 h。本次实验将所有样本分成高糖组(HG组), 正常组(NG组), 高糖联合GSE(高、中、低)组。实验前, 将GSE分成1.5、10 mmol/L溶液, 实验中以1∶1000为比例, 稀释为1.5、10 μmol/L的GSE。

1. 2. 2 细胞增殖能力检测 将对数系膜细胞加以收集, 调配好悬浊液浓度, 细胞种植在孔板内, 贴壁, 经16 h后, FBS同步, 更换新的培养液。将0、24、48、72 h视为观察点, 对增殖情况进行观察, 在此过程中, 吸去清液, 洗涤PBS, 弃置上清液。在每个小孔中加入新的培养液。后加入MTT液, 连续培养3 h, 后吸去孔内培养液。完毕后在孔内加入二甲基亚砜, 在恒温环境下培养15 min, 等到晶体溶解后, 使用监测设备测量吸光值, 计算活细胞数量。

1. 2. 3 蛋白/细胞数计算 各组细胞在刺激48 h后, 胰酶消化细胞, 计算各个小组总细胞数量。离心, 置入Ep管内, 增加裂解液, 0℃环境留置30 min, 离心, 上清液为蛋白量。

1. 2. 4 细胞周期检测 在各组细胞刺激48 h后, 洗涤PBS行双重洗涤, 消化完毕后, 离心收集, 放置在离心管内, 选择一定数量细胞, 使用酒精在4℃环境下固定, 连续12 h。计算前离心, 去掉乙醇, PBS双重洗涤, 将上述物品碘化丙啶, 暗处染色, 时长为7.5 min, 使用细胞仪收集样本, 经专业软件进行相关分析。

1. 2. 5 P21CIP和P27KIP蛋白量检测 选择浓度为0.25%胰酶消化细胞, 离心, PBS双重漂洗, 转入EP管, 混合RIPA裂解液, 以0℃环境冰浴。共计0.5 h, 离心, 上清液为蛋白。

使用二喹甲酸(BCA)法对蛋白浓度进行测定。蛋白电泳, 后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜, 使用丽春红染色处理, BSA/TBST封闭, 温度为4℃ , 在60 min后, 加入经稀释的P21CIP和P27KIP孵育12 h, 后使用TBST三重漂洗, 稀释, 标记好的羊抗兔孵育1 h, 使用TBST行三重漂洗, 显影, 胶片记录。

1. 3 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示, 采用t检验;计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组系膜细胞膜蛋白/细胞数情况 将NG组(2.31± 0.15)μg×104为比较对象, 在系膜通过高糖连续性培养2 d 后, HG组蛋白/细胞数(3.20±0.19)μg×104呈现出上升趋势, HG联合中剂量GSE组和HG联合大剂量组的细胞蛋白/细胞数比值(2.82±0.13)、(2.61±0.12)μg×104呈现出下降趋势, 差异有统计学意义(P<0.05)。

2. 2 系膜细胞的周期改变情况 将NG组为比较对象, 其他四组经高糖培养48、72 h后, 系膜细胞的增值水平减弱;HG联合中剂量GSE组和HG联合大剂量组明显比HG组要高, 差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2. 3 各组P27和P21蛋白质表达情况 将NG组为对比对象, 其他四组系膜细胞经过D-葡糖连续刺激2 d后, 两种物质的蛋白质水平显著提升(P<0.05)。经高糖联合GSE处理后, 以单独高糖组为研究对象, 证明GSE可全面对P21和P27起到抑制上升, 浓度存在依赖性, 差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2. 4 各组系细胞膜周期变化详情 将NG为比较对象, 系细胞膜经过高糖连续刺激48 h 后, 细胞G0/G1期的比例显著上升, 和S期相比显著减少, 差异有统计学意义(P<0.05)。HG联合中量GSE组和HG联合高量GSE组细胞的G0/G1比例下降, S期细胞明显提升, 差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

既往研究证实, DN细胞表型转化的先期特征为细胞异常肥大, 以系膜细胞为显著, 这种情况和DN后期病理存在较为显著联系[2]。由此能够看出, 对肥大的系细胞膜进行处理, 对于暂缓DN的进展均有十分显著的现实意义。

GSE有着生理和药理双重活性, 目前已经广泛应用于多种疾病临床治疗中。但值得说明的是, 当前关于GSE保护DN细胞和分子机制方面有待考察。在本次实验的相关研究结果中能够看出, 经30 mmol/L刺激之后, 系细胞膜体现出肥大, 且细胞的增殖能力明显下降, G0/G1细胞的百分数明显提升, 而S期内的百分数呈现出下降趋势。值得说明的是, 系细胞膜之所以出现肥大, 其主要原因和利用诱导细胞周期蛋白依赖性酶抑制物表达, 令系细胞膜再一次进入新的细胞周期时无法通过G1到达S期, 进而令细胞出现肥大现象。本次研究的另一项结果证实, 系细胞膜经高糖处理后, P27和P21的表达量明显提升。葡萄籽提取物呈现为依赖浓度性, 高糖诱导系细胞膜肥大, 进而令细胞总蛋白/细胞数量下降, 提升系细胞膜的增值水平, 令S期细胞比例上调, G0/G1比例下降。推进细胞膜会顺利通过G1期, 进而能够证明, GSE可全面抑制P27和P21的表达, 推进G1期, 对高糖诱导系细胞膜肥大起到拮抗作用。

综上所述, GSE可全面抑制高糖诱导系细胞膜肥大, 证明该物质能够全面缓解DN的疾病进展。

参考文献

[1] 郭卓雨, 高丽萍, 李贞.葡萄籽原花青素对顺铂诱导人胚肾细胞凋亡的拮抗作用.食品科学, 2014(1):234-238.

[2] 张庆, 杨志勇, 魏令, 等.葡萄籽提取物对人骨肉瘤U2OS细胞抑制作用及机制的研究.华中科技大学学报(医学版), 2014(2): 173-176.

[收稿日期:2016-01-25]

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