邓丽莎　施宇萌　王荣雪　冯若晨　王沁梅　戚馨月　汪海峰　周建新

[摘要]通过滤纸片法、平板计数法和生长曲线法等方法研究了花生壳分级萃取物对大肠杆菌的抑制作用。结果表明，不同溶剂花生壳萃取物对大肠杆菌的抑制作用存在差异性，乙酸乙酯萃取物抑菌效果最强，而且浓度越大，抑菌效果越强。不同溶剂花生壳萃取物对大肠杆菌的MIC和MBC也存在差异，乙酸乙酯萃取物最低，分别为31.255mg/mL和62.5mg/mL。其抗菌能力与萃取物中总多酚含量呈正相关，初步判定起主要抗菌作用的物质是多酚类。本研究为花生壳开发成高附加值天然粮食防霉剂或食品防腐剂提供依据。

[关键词]花生壳;分级萃取物;大肠杆菌;抑菌作用

中图分类号：TS207.3 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.201909

花生是我国重要的油料和经济作物，年产量达到1 450万t以上，加工成花生仁、油等过程中每年产生约450万t的花生壳。黄酮类、多酚类物质在花生壳中含量较高，具有抗菌、抗氧化、降血脂和胆固醇和治疗冠心病的作用[1]。但与发达国家相比，我国花生壳资源的开发和利用程度还相距甚远，仅作为燃料和肥料使用，用作农副产品下脚料方面尚未得到有效开发。林姣[2]研究表明花生壳含有丰富的黄酮类化合物，其中木犀草素含量较多且具有抗菌作用。杨洋等[3-4]确定了花生壳木犀草素最佳提取工艺，测定了花生壳木犀草素抑菌特性，其抑菌活性强于同浓度的山梨酸和亚硝酸钠。陈春涛等[5]以甲醇粗提、溶剂梯度萃取配合抑菌活性跟踪检测，得到了花生壳乙酸乙酯组分，并用酸碱沉淀、柱层析等法纯化得到3种化合物，发现这3种化合物都有一定抑菌效果。邢俊红[6]采用滤纸片抑菌圈法探讨花生壳多酚类物质对3种常见细菌的抑菌效果，结果表明花生壳多酚类物质对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的生长有很好的抑制作用，且对大肠杆菌的抑制作用最强。也有国内外学者研究或报道了黄酮类化合物的安全性，表明是无毒物质[7]，这些研究表明花生壳提取物具有抗菌性，具有作为天然粮食防霉剂或食品防腐剂的开发潜力，而不同溶剂的花生壳分级萃取物的抗菌性研究未见报道。以食品中常见的腐败菌和致病菌大肠杆菌为对象，研究了不同溶剂的花生壳分级萃取物对其的抑制作用，初步探索了抗菌机理，为其开发高附加值天然粮食防霉剂或食品防腐剂和高效开发花生壳资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基与试剂

大肠杆菌：江苏省疾病预防控制中心微生物试剂厂;牛肉膏、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司;琼脂：石狮市环球琼胶工业有限公司;平板计数琼脂：海博生物技术有限公司;石油醚、氯仿、乙酸乙酯（AR）：广东光华科技股份有限公司;无水乙醇（AR）：国药集团化学试剂有限公司;蒸馏水：实验室自制。

1.2 主要仪器与设备

FW100型高速万能粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司;SHZ-DⅢ型循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司;RE-2000型旋轉蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂;101-34S型电热鼓风干燥器：上海苏进仪器设备厂;LDZX-50FBS型立式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂;GNP-9160隔水式恒温培养箱：上海三发科学仪器有限公司;U-3900型紫外可见光光度计：日立高新技术公司;HZ1001A型电子天平：上海浦春计量仪器有限公司;BSC-1300ⅡA2 型生物安全柜：上海博讯实业有限公司医疗器械厂;ZQTY-70S型大容量低温摇床：上海知楚仪器有限公司;TDL-5-A型台式离心机：上海安亭科学仪器厂;镀铬游标卡尺（0～150mm）：桂林量具厂。

1.3 花生壳分级萃取物的制备

选取产自江苏省南通市的优质花生，手工剥壳并除去发黑、虫洞品。将花生壳清洗沥干后置于50℃烘箱中烘干4h，粉碎过40目筛。称取400.00g花生壳粉，滤布包扎，置于索氏抽提器内，先用石油醚萃取8h，收集石油醚溶液，过滤，旋蒸后冷冻干燥，得到石油醚萃取物，4℃保存备用。用相同的方法，对过滤后的残渣依次用氯仿、乙酸乙酯、无水乙醇和蒸馏水萃取，分别得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、无水乙醇萃取物和蒸馏水萃取物，用50%乙醇溶液定容至400mL，此时不同溶剂花生壳萃取物的浓度均为1 000mg/mL（原料花生壳/定容体积），并对萃取物倍比稀释成500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、32.15mg/mL。

1.4 实验方法

1.4.1 滤纸片法测定花生壳分级萃取物对大肠杆菌抑菌圈

取0.1mL大肠杆菌肉汤培养液（106-107CFU/mL）均匀涂布于平板计数琼脂平板上，将直径为6mm无菌滤纸片置于制备的萃取物溶液中浸泡3h，取出沥干后3个1组呈正三角形平铺皿中，以50%乙醇作为对照。倒置培养（36±1℃，24h）。用游标卡尺十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.4.2 平板计数法测定花生壳分级萃取物对大肠杆菌抑制率

在平板计数培养基中按照5%的添加量分别加入制备的不同溶剂和梯度浓度萃取物，同样以50%乙醇作为对照。灭菌，冷却，加入1mL大肠杆菌肉汤培养液，混匀，倾注平板。倒置在恒温箱培养（36±1℃，24h），计数，计算抑菌率。

（1）

1.4.3 花生壳乙酸乙酯和无水乙醇萃取物对大肠杆菌生长曲线的影响

试管中分别加入8mL肉汤培养基，0.5mL的500mg/mL、250mg/mL的花生壳乙酸乙酯和无水乙醇萃取物和1mL的大肠杆菌肉汤培养液，混匀，摇床培养（36±1℃，120 r/min），并在培养0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h时取出相应的试管，振荡器上振荡10s，使菌体均匀悬浮于培养基中，立即用紫外分光光度计600nm处测吸光度[8-9]。

1.4.4 花生壳分级萃取物最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定

准确量取10 mL营养肉汤培养基分装试管。配制含不同浓度的花生壳分级萃取物溶液的液体培养基，花生壳萃取物浓度梯度设为500mg/mL、250mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.625mg/mL、7.812 5mg/mL。每一系列梯度接种大肠杆菌培养液100ug。将液体培养基放入恒温振荡培养箱中培养（36℃，200r/min，12h）。浑浊的试管为阳性对照管，即为有菌生长;阴性对照管为透明试管，代表无菌生长。呈透明液体的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC）。将认为不长菌的试管（透明液体）从低浓度到高浓度取3支，各吸取1mL液体于培养皿中，加入营养琼脂培养基混匀，放入培养箱中培养（36±1℃），無菌落生长的最低浓度为最低杀菌浓度（MBC）[10]。

1.4.5 花生壳分级萃取物总多酚含量的测定（Folin-Ciocalteu法）

配制500μg/mL的没食子酸标准溶液。吸取标准溶液0.0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0 mL于10mL比色管中定容。从各溶液中吸取1 mL加入25 mL容量瓶内，加10 mL蒸馏水，1.5mL Folin-Ciocalteu试剂，在0.5～8min内加入6mL 10% Na2CO3溶液，加水定容，然后在30℃下避光放置反应2h，以0样为空白，在760nm处测定吸光度。吸光度（y）对浓度（x）的标准回归方程：y=3.500 3x+0.011 9，R2=0.999。准确移取1 000 mg/mL的各萃取物1mL于25mL容量瓶中，根据以上方法测定波长760nm处的吸光度，代入回归方程计算萃取液中总多酚浓度（萃取液中总多酚浓度按没食子酸标准品计）。

2 结果与讨论

2.1 滤纸片法测定花生壳分级萃取物对大肠杆菌抑菌圈

滤纸片法测定不同浓度花生壳分级萃取物对大肠杆菌的抑制效果见图1，抑菌圈直径越大，表明抑菌效果越好。从图中可以看出，同一浓度时，大多数乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌的抑制效果最显著，花生壳乙酸乙酯萃取物浓度越大，对大肠杆菌的抑制效果越好，而其他萃取物对大肠杆菌的抑制效果与浓度关系不大。

2.2 平板计数法测定花生壳分级萃取物对大肠杆菌抑制率

平板计数法测定不同浓度花生壳分级萃取物对大肠杆菌抑制率见图2，由图可知，在相同浓度时，抑菌效果为乙酸乙酯萃取物>乙醇萃取物>石油醚萃取物>氯仿萃取物>水萃取物;对于同种萃取物，随着浓度的增加，对大肠杆菌的抑菌效果增强。

2.3 花生壳乙酸乙酯和无水乙醇萃取物对大肠杆菌生长曲线的影响

花生壳乙酸乙酯、无水乙醇萃取物对大肠杆菌生长曲线的影响见图3，由图3可知，对于不加萃取物的对照组，大肠杆菌很快进入对数生长期，而实验组的大肠杆菌生长曲线的延滞期不同程度的延长，在生长期、稳定期时，数量也不同程度比对照组低。500mg/mL乙酸乙酯萃取物甚至无明显的对数生长期，菌量很低。

2.4 花生壳分级萃取物最低抑菌浓度（MIC）及最低杀菌浓度（MBC）的测定

MIC即最低抑菌浓度，指的是抑制细菌生长所需的最低药物浓度;MBC即最低杀菌浓度，指的是能够杀灭培养基内细菌（即杀死99.9%供试微生物）的最低浓度。花生壳分级萃取物对大肠杆菌的MIC及MBC分别见表1、表2，从表中可以看出，花生壳的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、无水乙醇、水萃取物对大肠杆菌的MIC分别为62.5、250、31.25、62.5和125mg/mL;而MBC则分别为125mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、62.5mg/mL和125mg/mL。因此，花生壳乙酸乙酯对大肠杆菌MIC及MBC都是最低的，能够在较低浓度下达到抑菌效果。

2.5 花生壳分级萃取物总多酚含量的测定

花生壳溶剂分级萃取物（1 000mg/mL）中总多酚含量的测定结果见图4。从图中可以看出，花生壳萃取物中总多酚含量最高的是花生壳乙酸乙酯萃取物，其次为无水乙醇、水、氯仿和石油醚萃取物，与上述抗菌结果比较，花生壳萃取物中的总多酚含量与对大肠杆菌抑菌效果呈正相关。

3 结 论

通过滤纸片法、平板计数法和生长曲线法测定了不同溶剂花生壳萃取物对大肠杆的抗菌活性，表明不同溶剂存在差异性，乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌的抑制效果最强。并且花生壳乙酸乙酯萃取物浓度越大，对大肠杆菌的抑制效果越强。

不同溶剂花生壳萃取物对大肠杆菌的MIC和MBC也存在差异，乙酸乙酯萃取物最低，分别为31.25 mg/mL和62.5mg/mL。

不同花生壳分级萃取物中的总多酚含量不一样，含量与其抗菌能力呈正相关，初步判定花生壳分级提取物中起主要抗菌作用的物质是多酚类。

参考文献

[1] 杨国峰，周建新，汪海峰，等.花生壳提取物的制备及其抗氧化与抗菌活性的研究进展[J].食品与发酵工业， 2007，33（2）： 97-101.

[2] 林姣.花生壳木犀草素的提取分离及抗菌作用的研究[D].南京： 南京财经大学，2013.

[3] 杨洋，聂静然，关红艳，等.花生壳木犀草素的提取及其抑菌性能研究[J].食品科技，2009，34（12）：211-216.

[4] 聂静然.花生壳中木犀草素的分离提纯及其抑菌性能研究[D].南宁：广西大学，2018.

[5] 陈春涛，马庆一，高玉美，等.花生壳中木犀草素等抑菌活性成分的提取、纯化与研究[J].食品科学，2003，24（5）：84-88.

[6] 邢俊红.花生壳多酚的提取工艺及活性研究[D].大连：大连工业大学，2015.

[7] ZGORKA G A，HAJNOS A A.The application of solid-phase extraction and reversed phase high-performance liquid chromatography for simultaneous isolation and determination of plant flavonoids and phenolic acids[J].Journal of Chromatography A，2006，1137（2）：145-152.

[8] 龙海荣.黄酮类化合物的安全性研究进展[J].食品研究与开发， 2008（10）：154-157.

[9] 冯亚净，张媛媛，王瑞鑫，等.五味子木脂素对大肠杆菌的抑菌机理及效果[J].食品与发酵工业，2016，42（2）：72-76.

[10] 周琰冰，赵鑫荟，艾启俊.三种中草药对大肠杆菌的抑制作用及机理初探[J].中国农学通报，2013，30（12）：294-300.

[11] 赵二劳，武宇芳，白建华.花生壳不同溶剂提取物的总酚含量及抗氧化性的比较研究[J].食品科学，2012，33（11）：79-81.