游 刚，牛改改*

（广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用高校重点实验室，北部湾大学食品工程学院，广西 钦州 535011）

方格星虫（Sipunculus nudus）又称光裸星虫、沙虫，广布我国南北沿海，其中广西北部湾海域资源较为丰富[1]。关于方格星虫的研究主要集中在繁殖育种[2]、形态特征[3]、基因调控[4]、免疫活性[5]等方面。近年来，方格星虫生物活性成分和酶解肽的制备及其抗氧化性研究已有相关文献报道[6-10]。但是，由于酶解过程中引起的脂质氧化、蛋白质降解，加重了酶解物的腥苦味，影响整体风味和滋味。Maillard反应是在一定条件下由氨基官能团和羰基官能团通过缩合、环化和聚合等形成羰氨化合物的非酶褐变反应[11]。相关研究报道了Maillard反应可改善酶解物的感官特性和挥发性风味[12-13]；此外，不同种类糖对Maillard反应机制影响不同[14-15]，阐明不同种类糖对Maillard反应影响机制是控制形成目标产物的有效手段之一[14]。不同加工方式（水煮或油煎）对方格星虫肉挥发性风味物质成分变化的影响已有报道[16]，然而，关于方格星虫酶解物（Sipunculus nudus enzymatic hydrolysates，SEH）与不同种类糖的Maillard反应特性及其产物挥发性特征风味变化的研究较缺乏。所以，本实验研究不同种类糖（葡萄糖、麦芽糖、木糖和阿拉伯胶）与SEH在一定条件下形成Maillard反应产物的褐变度、pH值、色差、总/游离氨基酸、荧光强度和特征风味变化，旨在为改善酶解物的风味和品质选择更好的糖基供体提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜方格星虫（体长（10±2）cm，体宽（1±0.5）cm，体质量（9±2）g） 广西南宁安吉海鲜市场。

碱性蛋白酶、风味蛋白酶 索莱宝生化试剂有限公司；1,2-二氯苯（纯度＞99%） 南京化学试剂有限公司；HCl、NaOH（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

L-8900氨基酸分析仪 日本Hitachi公司；RF-5301PC荧光分光光度计 日本岛津公司；PEN3型便携电子鼻 德国Asrinese公司；CM-3600d分光测色计日本柯尼卡·美能达公司；UV6100紫外-可见分光光度计上海美谱达公司；STAR A111 pH计 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

参照赵谋明等[17]报道的方法制备酶解物和Maillard反应产物。将方格星虫去内脏、清洗、沥干，搅碎。称取一定量的碎肉与去离子水按1∶5（g/mL）混合，于85 ℃水浴中加热30 min，冰浴、冷却至室温。调节pH 9.0，按底物质量的3%加入碱性蛋白酶（20万 U/g），于50 ℃水浴中酶解120 min。然后，调节pH 6.5，加入等量的风味蛋白酶（30 000 U/g），相同温度下继续酶解120 min后，95 ℃灭酶10 min，随后冰浴、冷却至室温。酶解液于8 000 r/min离心15 min，收集上清液（酶解物SEH）、冻干备用。

分别称取一定量的冻干粉和不同种类的糖（冻干粉-糖质量比0.75∶1）溶于去离子水中，调节pH值至6.8，制备SEH和不同糖的混合体系（7 g/100 mL），于120 ℃反应120 min后，立即冰浴、冷却，于－20 ℃保存备用。不同种类的糖与酶解肽混合形成的Maillard反应体系为：酶解物-葡萄糖（SEH-glucose，SEHG）、酶解物-麦芽糖（SEH-maltose，SEHM）、酶解物-木糖（SEH-xylose，SEHX）和酶解物-阿拉伯胶（SEH-acacia，SEHA）。

1.3.2 吸光度测定

参考文献[15]，采用紫外-可见分光光度计分别于波长294 nm和420 nm处测定吸光度。

1.3.3 色差测定

参考文献[13]，采用分光测色计测定样品的颜色参数变化：L*（亮度）、a*（＋红色，－绿色）、b*（＋黄色，－蓝色）、C*（色度）和ΔE（总色差）。其中C*=（a*2＋b*2）1/2，ΔE=（ΔL*2＋Δa*2＋Δb*2）1/2。采用去离子水作为参比。

其四，从审计未来角度看，CPA审计寻租影响审计行业的健康发展。会计师事务所的低价揽客等寻租活动和较低的审计质量，会导致社会公众对CPA行业失去信任，这会影响CPA行业未来的良性发展。

1.3.4 总氨基酸和游离氨基酸测定

总氨基酸测定参考文献[13,18]，并稍作修改。分别取1 mL样品盛入水解管中，加入8 mL HCl溶液（6 mol/L）于110 ℃水解22 h，冰浴、冷却至室温。将消解液过滤、定容至50 mL，取1 mL水解液于100 mL烧杯中，置于60 ℃水浴中赶酸完全，用超纯水定容至10 mL，取2 mL过0.22 μm膜后采用自动氨基酸分析仪测定。

游离氨基酸测定参考文献[13,18]，并稍作修改。分别取10 mL样品加入10 mL 10%的三氯乙酸溶液沉淀120 min，8 000 r/min离心15 min，取2 mL上清液过0.22 μm膜后采用自动氨基酸分析仪测定。

1.3.5 内源性荧光发射光谱扫描

参考文献[19]，采用荧光分光光度计扫描样品内源性荧光强度变化。扫描参数设定为：激发波长298 nm，发射光谱扫描范围309～450 nm，狭缝宽度5 nm，扫描温度25 ℃。

1.3.6 电子鼻测定

参考文献[20]，取25 mL样品置于50 mL离心管中，保鲜膜密封，置于50 ℃水浴中加热10 min，进行测定。设定参数为：传感器室流量300 mL/min，测量样品流量300 mL/min，清洗120 s，测量90 s。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0软件对3 次重复实验数据进行统计分析，P＜0.05，差异显著；采用Origin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 吸光度和pH值变化

反应产物的颜色变化是一种直接、简单判断Maillard反应程度的方法[21]。在294 nm波长处的吸光度可用于检测Maillard反应速率[22]，在420 nm波长处的吸光度可反映Maillard反应体系的褐变度[15]。图1显示了不同种类糖与SEH结合形成Maillard反应产物的吸光度（A420nm、A294nm）和pH值变化。混合体系反应产物的吸光度均高于SEH，表明不同糖与SEH之间发生Maillard反应；且SEHX反应产物的A420nm和A294nm均显著高于其他组（P＜0.05），表明木糖参与Maillard反应的程度要高于其他糖（葡萄糖、麦芽糖和阿拉伯胶），与Laroque等[14]报道戊糖褐变速率较高的结论一致；同时，从反应体系pH值变化可知，SEH经加热后pH值无显著性变化，但Maillard反应产物的pH值均显著减小（P＜0.05），其中SEHX产物的pH值最小，归因于Maillard反应过程中糖、氨基酸和肽等降解和相互作用形成了酸性化合物[21]。另外，不同糖对反应产物A420nm和A294nm的影响呈现相同趋势，与Pirestani等[23]研究结果类似。Ajandouz等[22]研究发现A294nm增大表明反应体系形成一类无色的化合物，它们是形成褐色素和产生焦糖化反应的基础物质。因此，A420nm和A294nm在Maillard反应进程中具有一定的关联性。此外，Chevalier等[24]报道了短链多糖较长链多糖展现出较快的反应速率，它能够解释木糖参与的反应体系呈现较高的A420nm和A294nm的原因，但与本实验得到的A420nm和A294nm（阿拉伯胶＞麦芽糖＞葡萄糖）的结果相反。这可能是因为：1）阿拉伯胶与SEH发生Maillard反应程度高于麦芽糖和葡萄糖，Pirestani等[23]证实了阿拉伯胶是一种较为适合的多糖易与蛋白质在一定条件下发生共聚接枝反应；2）发生Maillard反应时较高的反应温度和较长的反应时间（120 ℃、120 min）可诱导焦糖化反应，Buera等[25]发现不同糖发生焦糖化反应的褐变强度大小为麦芽糖＞葡萄糖，与本实验研究结果一致。根据图1结果可以看出褐变度大小为木糖＞阿拉伯胶＞麦芽糖＞葡萄糖。

图1 SEH与不同种类糖Maillard反应产物的A420 nm、A294 nm和pH值的变化Fig. 1 Changes in A420 nm, A294 nm and pH of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides

2.2 色差变化

食品颜色是由食品原料本身的颜色或者食品加工过程中产生有色物质形成的[26]。表1显示了SEH与不同种类糖Maillard反应产物的颜色参数（L*、a*、b*、C*和ΔE*）变化。L*表示亮度，反映黑白组分；a*表示红绿度，正值越大越偏向红色，负值越大越偏向绿色[27]；b*表示黄蓝度，正值越大越偏向黄色，负值越大越偏向蓝色[27]；C*表示视觉颜色的饱和度、纯度或强度，定义为从灰色（a*＝0和b*＝0）向纯彩色的偏离程度；ΔE*表示总色差，值越大说明颜色变化越重。不同种类糖与SEH经Maillard反应后产物颜色均发生显著变化：1）Maillard反应产物的L*均显著减小（P＜0.05），其中SEHX产物的L*最小，亮度最暗；2）Maillard反应产物的a*均增大，且SEHX产物的a*最大，表明反应产物的红色加深；3）Maillard反应产物的b*均增大，且SEHX产物的b*最大，表明反应产物的黄色加深，褐变程度最大[27]，不同糖对应的b*大小顺序（木糖＞阿拉伯胶＞麦芽糖＞葡萄糖）与2.1节部分结果一致；4）Maillard反应产物的C*均增大，且SEHX产物的C*最大，表明反应产物的颜色加深，色度增大[13]；5）Maillard反应产物的ΔE*均增大，且SEHX产物的ΔE*最大，表明反应产物的颜色加深。以上结果可以看出，木糖与SEH发生Maillard反应的程度最高，其次是阿拉伯胶，与反应产物的A294nm和A420nm变化结果一致。

表1 SEH与不同种类糖Maillard反应产物的颜色参数变化Table 1 Changes in color parameters of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides

2.3 游离氨基酸和总氨基酸含量变化

在Maillard反应过程中，糖分子结构中的羰基和游离氨基酸或肽发生共聚结合形成Schiff碱，因此游离氨基酸含量变化可反映SEH与不同糖之间的反应程度[28]。表2和表3分别显示了SEH与不同糖Maillard反应前后游离氨基酸和总氨基酸含量变化。SEH的总氨基酸含量为904.073 mg/g，总游离氨基酸含量为202.963 mg/g，水解度（总游离氨基酸/总氨基酸）约为22.4%。由表2可知，SEH与不同糖发生Maillard反应后，反应产物的17 种游离氨基酸和总游离氨基酸含量较SEH均显著降低（P＜0.05），表明氨基酸和肽结构中的α-氨基和ε-氨基与糖分子结构中的羰基结合形成共聚物，使得氨基酸含量减小[14]。经Maillard反应后，产物氨基酸含量变化差异主要与糖的反应活性有关。Chevalier等[24]证实了在一定条件下不同种类糖与蛋白质之间共聚作用力不同，例如，β-乳球蛋白和戊糖（核糖、阿拉伯糖）形成共价键，而与己糖（葡萄糖、乳糖）形成疏水作用和二硫键，与糖的反应活性有关。因此，Laroque等[14]认为反应后混合体系中可利用的氨基减少量越大对应糖的反应活性越强。然而，表2研究结果显示总游离氨基酸含量大小顺序为SEHM＞SEHX＞SEHG＞SEHA，该结果并不能说明对应糖的反应活性大小，因为糖和酶解肽在热处理过程中（120 ℃），肽经历两种路径转化：一方面，大分子肽分解成小分子肽和氨基酸，另一方面，肽与糖或降解产物直接交联形成高分子产物[21,29]。从褐变度结果可知，SEHX＞SEHA＞SEHM＞SEHG，结合表3显示的总氨基酸含量大小顺序为SEHM＞SEHG＞SEHA＞SEHX，由此推测SEH和木糖反应体系中肽大部分分解成小肽和氨基酸，补充Maillard反应消耗的氨基酸，促进了木糖和氨基酸的反应，进而减小了其总氨基酸含量；在SEH和阿拉伯胶反应体系中，肽转变成氨基酸的程度小，可能与多糖的空间位阻作用有关[15]，因此，Maillard反应后消耗的氨基酸不能有效补充，导致总游离氨基酸含量最低，同时，分析总氨基酸含量变化结果，推测阿拉伯胶可能与肽直接作用，进而减小了总氨基酸含量；在SEH和麦芽糖反应体系中，总游离氨基酸含量最高的原因可能是麦芽糖更倾向与小肽相互作用，促进了大分子肽分解成小分子肽和氨基酸，从而增大了体系总游离氨基酸含量；而SEH和葡萄糖反应体系的总游离氨基酸含量最低归因于其Maillard反应程度小，但其总游离氨基酸含量高于SEHA可能是因为大分子肽转变成氨基酸的程度要高于SEH和阿拉伯胶体系[15]。这与Huang Xiaoqin等[15]报道结果有一定的差异归因于反应原料（氨基酸、酶解肽）和条件（温度、pH值、底物浓度等）的不同，不能进行有效的结果对比分析。

表2 SEH与不同糖Maillard反应前后游离氨基酸含量变化Table 2 Variations in free amino acid composition of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides mg/g

酶解物中的肽含有疏水性氨基酸，它们导致终产物呈现苦味而被称之为苦味氨基酸[30]。在所测17 种氨基酸中（表2），有8 种苦味氨基酸Val、Leu、Ile、Met、Phe、Ser、Arg、His，其中Arg、His和Met呈现强苦味[21]。SEH与糖Maillard反应产物的总苦味氨基酸含量均显著降低（P＜0.05），其中SEHA中的总苦味氨基酸含量最低，SEHM中的含量最高，改善了酶解液的苦味。Lan Xiaohong等[21]研究发现Maillard反应减少了大豆蛋白肽的苦味氨基酸含量，支持了本研究结果。此外，表3显示Maillard反应产物的每种氨基酸含量低于SEH，可能是由于Strecker降解、热分解、以及糖和氨基酸或肽结合形成Maillard产物导致[21]，这与Liu Ping等[18]研究结果一致。从不同糖对总氨基酸减少率大小顺序分析即SEHM（19.967%）＜SEHG（22.050%）＜SEHA（23.399%）＜SEHX（35.172%），可推断出不同糖与SEH的反应程度大小顺序为木糖＞阿拉伯胶＞葡萄糖＞麦芽糖，与褐变度变化和色差分析结果一致。

表3 SEH与不同糖Maillard反应前后总氨基酸含量变化Table 3 Variations in total amino acid composition of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides mg/g

2.4 内源性荧光强度变化

内源性荧光强度变化可用于评价反应体系中糖与蛋白质或肽共聚形成Maillard反应产物而引起的结构变化[31]。图2显示了SEH和SEH与不同糖形成的反应产物的内源性荧光光谱图。SEH与不同糖反应后，荧光强度显著降低，其中最大荧光强度大小顺序为SEH＞SEHM＞SEHG＞SEHA＞SEHX，且SEHX荧光吸收峰几乎消失，归因于不同糖与SEH共聚结合具有一定屏蔽效应[15]，木糖对SEH构象的影响最大，其次是阿拉伯胶、葡萄糖和麦芽糖，这与不同糖和SEH的反应程度大小顺序（即：木糖＞阿拉伯胶＞葡萄糖＞麦芽糖）的结论一致。另外，与SEH比较，Maillard反应产物的最大吸收峰发生轻微红移，表明SEH中的肽或蛋白质分子结构中酪氨酸（Tyr）暴露于亲水性环境，三级结构发生改变[32]。Huang Xiaoqin等[15]研究不同糖（葡萄糖、乳糖、麦芽糖和淀粉）与卵清蛋白Maillard反应产物的荧光强度变化，发现蛋白质-糖共聚物的荧光强度显著降低，支持了本实验结果。

图2 SEH与不同种类糖Maillard反应产物的内源性荧光光谱图Fig. 2 Intrinsic fl uorescence intensity of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides

2.5 电子鼻分析

2.5.1 传感器的G/G0响应值分析

表4 SEH与不同种类糖Maillard反应产物的气味响应值Table 4 Odor response values of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides

电子鼻检测传感器探测到样品挥发性物质成分后，由此产生的电导率G/初始电导率G0比值变化作为信号响应，若G/G0响应值偏离1（小于或者大于1），表示对挥发性成分气味有响应，其风味贡献大，若G/G0值接近或等于1，表示没有对气体无感应或气体浓度低于检测限[33]。SEH与不同种类糖Maillard反应产物的气味响应值如表4所示，其对应的直观雷达图如图3所示。4号和5号传感器G/G0响应值接近1，表明氢气和烷烃类挥发性成分对SEH和Maillard反应产物风味无贡献。1号和3号传感器G/G0响应值均小于1，说明SEH和Maillard反应产物均含有芳香苯类和氨类挥发性成分，添加葡萄糖、麦芽糖和阿拉伯胶对SEH反应产物对芳香苯类和氨类挥发性成分影响不大，然而，添加SEHX对应的G/G0值小于其他组，表明木糖对对SEH反应产物对芳香苯类和氨类挥发性成分影响较大。10号传感器G/G0响应值均大于1，且相互之间差异不大，表明Maillard反应前后芳香烷烃类挥发性成分变化不明显。另外，2、6、7号和9号传感器G/G0响应值偏离1，且相互之间差异明显，表明SEH与糖发生Maillard反应前后，氨氧化物、甲烷、硫化氢类成分变化较大，其中添加木糖组的SEHX风味成分变化最明显。袁林等[12]采用同样的方法分析了牡蛎酶解产物及其Maillard反应产物的挥发性风味变化。

图3 Maillard反应产物的气味响应值的雷达图Fig. 3 Response value radar chart of odor in Maillard reaction products

2.5.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）结果

图4 SEH与不同种类糖Maillard反应产物的电子鼻PCA图Fig. 4 PCA plot of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides

PCA是通过提取传感器的多指标信息，通过数据转换、降维和线性分类，得到两维散点图，经过PCA方法转换后得到的PC1和PC2的贡献率累计方差大于总方差的85%，表明主要成分可较好地反映样品的信息[33-34]。图4显示了SEH及其对于的Maillard反应产物的电子鼻响应值PCA结果。PC1的贡献率为99.47%，PC1和PC2的总贡献率为99.92%，表明PCA能较好地反映原始高维矩阵数据信息。SEH和Maillard反应产物（SEHG、SEHM、SEHX和SEHA）风味响应值没有重叠区域，表明电子鼻PCA方法可有效区分SEH反应前后产物的特征风味变化。整体上看，与SEH风味响应轮廓比较，SEHG和SEHM距离较近，而SEHA和SEHX距离较远，表明添加木糖或阿拉伯胶对Maillard反应产物的特征风味影响较大，同时葡萄糖和麦芽糖对Maillard反应产物特征风味的影响效果较接近。不同种类的糖对反应产物的特征风味产生不同影响可能与其参与Maillard反应程度有关。

2.5.3 负荷加载分析结果

图5展示了方格星SEH与不同种类糖Maillard反应产物的电子鼻负荷加载分析，可清晰地呈现每个传感器对PCA的贡献率。3、4、5号和10号传感器位于坐标（0,0）附近，且位置相邻，表明传感器信号变化较弱，对应的风味（氨类、氢气、烷烃和芳香烷烃类成分）贡献率较小。1号和8号传感器在PC1和PC2上贡献率相当，响应值偏小，2号和7号传感器在PC1上贡献率较大，6号和9号在PC2上贡献率较大，表明氨氧化物、甲烷、硫化氢类成分是区别SEH和SEH-糖反应产物的主要挥发性特征风味，这与2.5.1节不同传感器响应值的研究结果吻合。

图5 SEH与不同种类糖Maillard反应产物的电子鼻负荷加载分析图Fig. 5 Loadings analysis of Maillard reaction products formed by SEH conjugating with different saccharides

2.5.4 线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）结果

LDA倾向于将所测样品在空间中的分布状态及彼此之间的距离分析等信号数据通过运算法则投影到某一方向，使得不同样品组间的投影尽可能分开[34]。图6显示了SEH与不同种类糖Maillard反应产物的电子鼻LDA图。判别式LD1和LD2的贡献率分别为94.32%和4.55%，两判别式的总贡献率98.87%，基本上可代表样品的主要信息特征。采用LDA能够较好区分SEH和SEH-糖反应产物的特征风味差异性。值得注意的是，采用LDA，可明显区分SEHG和SEHM特征风味，好于PCA效果。对于SEHA和SEHX，LDA和PCA区分效果相似。因此，尽管LDA和PCA两种方法都能应用于SEH和不同糖Maillard反应产物特征风味的区分，由于LDA判别法考虑了种类间差异及组内集中程度，并最大化处理，所以总体上LDA区分效果好于PCA，更适合用于SEH-糖Maillard反应产物特征风味的区分。这与李靖等[35]采用电子鼻快速检测油炸油品质发现LDA较PCA更适合区分油品品质的结论一致。

图6 SEH与不同种类糖Maillard反应产物的电子鼻LDA图Fig. 6 LDA of Maillard reaction products formed by SEH conjugating with different saccharides

3 结 论

不同种类的糖与SEH反应后，Maillard反应产物的褐变度均增大、pH值均减小，L*均减小且a*、b*、C*和ΔE*均增大，产物的17 种游离氨基酸和总氨基酸含量较SEH均显著降低，其中8 种苦味氨基酸含量显著降低，改善了酶解液的苦味，从褐变度、色差变化、氨基酸含量变化、荧光扫描光谱结果分析，不同糖与SEH的反应程度大小顺序为木糖＞阿拉伯胶＞葡萄糖＞麦芽糖，且SEH三级结构发生改变。电子鼻能够较好地区分SEH与不同糖形成的Maillard反应产物特征风味，负荷加载分析表明氨氧化物、甲烷、硫化氢类成分是区别SEH和Maillard反应产物的主要挥发性特征风味。因此可根据工艺需求选择合适的糖基供体与SEH发生Maillard反应制备目标产物。后续实验将进一步采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用定性定量分析酶解物与不同种类糖的Maillard反应产物挥发性风味成分变化，分析并找出主要风味贡献成分，在分子水平上解释不同糖与酶解物Maillard反应形成挥发性风味成分机制，为改善酶解物的风味和品质选择更好的糖基供体提供理论参考。