何飞宇

[摘要]芒果是重要的经济果树之一，富含多糖、单宁、多酚等次生代谢的干扰物质，不易获取DNA。基于此，为提升提取DNA的质量，以芒果属植物为研究对象，通过对比芒果与扁桃成熟叶片中的DNA质量情况，分析芒果属植物叶绿体的DNA提取方法。

[关键词]芒果属;植物叶绿体;DNA;提取方法

[中图分类号]S667.7[文献标识码]B

我国多个芒果属中芒果的经济效益最高，栽培范围最广。我国是栽培芒果的重要国家，并且芒果资源较为丰富，种类已达到1000多种。已有学者采用植物学、生物化学、分子生物学等方式鉴定芒果属的果类种质与亲缘关系，但从总体来看采用植物叶绿体提取芒果属的DNA较为方便。

1 实验试剂与过程

实验地点为广西壮族自治区亚热带作物研究所。实验的材料为芒果、扁桃。实验药品有Buffer I：50 mmol·L-1 Tris C（pH值为8.0），30 mmol·L-1 EDTA，1.2 mol·L-1 NaCl，0.2 mol·L-1 Vc（抗坏血酸），10 g·L-1 PVP即聚乙烯毗咯琳酮C（pH值为3.6）。Buffer II：50 mmol·L-1 Tris（pH值为8.0），30 mol·L-1 EDTA，1.2 mol·L-1 NaCl，5 mmol·L-1 p-琉基乙醇，p=0.1%（W/V）BSA（牛血蛋清白）。Buffer III：120 mmol·L-1 NaCl，80 mmol·L-1 EDTA，10 g·L-1 PVP C（pH值为8.0）。Buffer IV：50 mmol·L-1 Tris（pH值为8.0），30 mmol·L-1 EDTA。TE：0.4 mol·L-1 NaCl，10 mmol·L-1 Tris-HCl，1.0 mmol·L-1 EDTA。

采用绿色、健康、无病虫害的叶片数张，采集后将其放置在预冷的水壶中，然后将其快速带入实验室，然后再用干净的纱布擦拭干净，应保证叶片干净后才能开展相关的实验工作。同时，再用锡箔纸来包裹叶片做好遮光工作，将其放置在4 ℃的环境内48 h，之后再经过液痰后快速进行冷冻处理，然后将其放置在-70 ℃的保存箱内进行备用。

2 实验具体方法

2.1芒果DNA检测

提取芒果的基因组质量，与提取材料和材料保存有关。砖红色的幼嫩芒果叶片材料，含有丰富且高浓度的DNA基因组;由于保存时间或是老化现象，提取DNA基因组时芒果叶片中的单宁、多糖、多酚等一些次生代谢的物质含量较高。提取芒果DNA基因组时，应将材料保存好，并做好前期的材料准备工作，此外也应注重提取芒果基因组DNA的操作技术，确保芒果属DNA基因组的提取质量，例如采用液氮方法研磨材料。

2.2实验方法cPDNA的电泳检测和OD值的测定

实验时取出2 μL的cpDNA溶液，然后在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳，并将电泳的缓冲设置为0.5×TBE、电泳设置为45 min、恒压设置为110 V，并在紫外凝胶成像系统内观察测试结果，然后在对成像拍照。针对来自8个扩增不同液体的植物叶绿体DNA的SSR引物，其反应体系为2 μL（5 U·μL-1） Taq DNA Polymerae、1μL（10μmol·L-1）Forword Primer、0.5μL×dNTP、1μL20ng/μL葉绿体DNA，加ddH2O到20μL。其反应程序如下：95 ℃ 5 min、95 ℃ 1 min，退火1 min，退火的温度因物而异;72 ℃ 2 min，32次循环，最后72 ℃ 10 min时，电泳检测检测PCR产物。

2.3叶绿体的显微观察

将1 mL BufferⅡ的溶液与叶绿体融合，并将其放在载玻片上，然后用盖玻片将其盖住，将其制成临时装片，采用100×油镜观察叶绿体。

2.4CTAB的提取法

将CTAB作为提取芒果基因组的DNA，有关研究学者采用这种方法在提取液当中加入PVP粉末和β-的巯基乙醇等一些抗氧化的试剂保护机体组的DNA，避免其与多酚类物质结合。还有的研究学者采用了24∶1的酚氯仿异戊醇混合液抽，经过将CTAB提取液进行恒温水浴后得到了清液，然后将其重复抽提2次，抽提的溶液和上清溶液两者的体积比例是1∶1，在一般情况下采用饱和酚∶异戊醇∶氯仿=25∶1∶24混合的溶液对其进行抽取，而如果采用这种方法时将饱和酚去除，也能将芒果属中的高质量基因组的DNA提取出来。

2.5试剂盒提取

采用康为世纪公司的Mango Gen DNA Kit的芒果基因组DNA提取试剂盒，将DNA提取出来，但通过紫外分光光度计检测发现采用这种方法提出芒果基因组DNA的浓度相对较低，并且采用这种方式的投入较大、花费较高。对比试剂盒法、高盐-低pH法、CTAB提取法提取植物叶绿体DNA的效果，采用DNAout试剂盒法能够清除物质植被中的蛋白质、多糖、酚类等代谢物质，得出OD230/OD260>2.000，OD280/OD260约1.800，采用高盐-低pH方法所提取的叶绿DNA的产率较高，高于75.8 ng·μg-1。

2.6 检测叶绿体DNA中的SSR

采用叶绿体DNAout试剂盒、高盐低PH的cpDNA等提取方法，并使用SSR引物，选出8对，扩增cpSSR数量，由此能够得出采用cpDNA提取方法具有一定的可靠性。

使用扁桃与芒果的cpDNA作为基本模板，使用引物来扩增PCR，通过验证得出采用以上两种方法能够扩增出层次清晰、亮度更好、完整性较好的谱带。由此能够得出，采用这两种方法在提取物质中cpDNA的浓度时较为理想，质量相对较高，能够将其用于开展后期工作。

2.7 显微观察芒果属的植物叶绿体

采用植物叶绿体的DNAout与高盐-低pH检测方法，能够得出高纯度、杂质少、背景清晰的叶绿体显微成像，因此可以将这两种方法应用于提取扁桃和芒果DNA叶绿体，但是采用高盐-PH提出的叶绿体细胞的浓度较高。两种提取方法的分析结果如表1所示。

2.8 SDS提取

使用高盐的TE溶液，将0.8 mol·L-1 NaCl加入TE的溶液中，在溶液中加入NaCl能够检测样品中的多糖含量，有效减少溶液中的其他物质造成干扰。通过提升SDS缓冲溶液的浓度，能够有效减少提取基因组DNA的时间，并且也保障提取基因组DNA的质量。使用这种提取方法能够不断增加PCR的含量，但是产物的质量和效率可能会出现不同的结果。此外，也应该合理控制提取的时间与所研磨颗粒的粗细度。

3 结果分析

在研究叶绿体基因组的过程中，提取优质的cpDNA是提取芒果属的前提，采用叶绿体基因组提取方法与全基因组DNA的提取方法相比，cpDNA难度大。cpDNA存在于叶绿体的细胞中，分离难度大;线粒体DNA与核DNA提取cpDNA时，会受到干扰，从而制约了获取cpDNA效率。在提取cpDNA时，获得较为完整的叶绿体能保障cpDNA的获取质量。也可在冰上操作，但要做好研钵经液氮预冷工作，由此能减少组织的褐化程度，并保障叶片组织能够充分冻结，保障叶绿体的完整性。高盐-低pH的提取率较高，叶绿体DNAout的试剂盒方法操作較为简单，提取出的cpDNA质量较好。采用这两种方法都能获得实验所要求的cpDNA，从提取的产率角度来看，采用高盐-低pH的实验方法相对较好，但从操作简单和提取质量的角度来看，采用叶绿体DNAout的试验盒方法较好。

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