任召珍 陈志兵 刘志敏

摘要：建立鲫鱼中硝基呋喃代谢物残留量测定的液相色谱-串联质谱分析方法，并分析AOZ在鲫鱼中残留消除规律。样品采用盐酸、2-硝基苯甲醛衍生提取，乙酸乙酯萃取后，进行液相色谱-串联质谱测定，同位素内标定量。结果显示，该方法在0～20.0 μg/L范圍内线性关系良好，4种硝基呋喃类代谢物回收率在91.7%～98.5%之间，相对标准偏差为1.87%～6.93%，方法检出限为SEM 0.40，AOZ 0.25，AMOZ 0.20，AHD 0.45。鲫鱼内AOZ残留消除试验发现，AOZ停药后最高蓄积残留量为218.25 μg/kg。鲫鱼肉内AOZ代谢消除缓慢，120 d后代谢残留物低于0.5 μg/kg。

关键词：液相色谱-串联质谱;硝基呋喃代谢物;鲫鱼;代谢规律

中图分类号：TS207   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）12-0238-04

硝基呋喃类药物是一种抗生素，其代谢物主要有5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）、1-氨基-2-内酰脲（AHD）、3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）4种，对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用，主要用于防治敏感菌所致的细菌性痢疾、肠炎、霍乱。由于其广谱的杀菌能力曾被广泛应用于养殖业，但研究发现该类药物具有相当大的毒性，可致胎儿畸形、诱发癌症等[1-2]。欧盟关于修订有关指定用于确定最大残留限量的共同体程序的第2377/90/EEC（1995）号指令中把硝基呋喃列入A类禁用药[3]，并于2003年规定最低残留限量（MRL）为1 μg/kg[4]。我国动物性食品中兽药最高残留限量——农业部235公告也明确规定，此类药物不得在动物性食品中检出[5]。即便如此，硝基呋喃类代谢物在动物源食品中仍时有检出。据山东省食品药品监督管理局发布的食品安全通报发现，黄花鱼、松花鱼、鸡肉等多起动物源食品中呋喃唑酮代谢物超标[6]。目前，硝基呋喃代谢物的分析方法有酶联免疫法[7]、高效液相色谱法[8-9]和高效液相色谱-串联质谱法[10-13]。其中，液相色谱-串联质谱法因其灵敏度高、准确性和重复性好等特点得到广泛应用。本试验在此基础上以鲫鱼为研究对象，采用更为便捷的检测方法对鲫鱼中硝基呋喃类代谢物进行测定，并对呋喃唑酮的代谢规律进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 甲醇、乙酸乙酯、正己烷、甲酸、2-硝基苯甲醛、醋酸铵皆为色谱纯;盐酸、氢氧化钠、磷酸氢二钾皆为分析纯;标准品购自德国Dr. Ehrenstorfer标准品公司，纯度≥99.0%;水为超纯水。

1.1.2 硝基呋喃代谢物标准储备溶液 采用甲醇溶液分别将AOZ、AMOZ、AHD、SEM溶解配制成100 mg/L的标准溶液，置于-18 ℃冰箱避光保存。

1.1.3 混合标准中间溶液 分别准确吸取适量标准储备溶液，将以上4种硝基呋喃代谢物配制成浓度为10 mg/L的混合标准中间溶液，置于-18 ℃冰箱避光保存。

1.2 仪器和设备

高效液相色谱串联质谱仪（LC-MS/MS）：Thermo TSQ Quantum Access Max，电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司];旋转蒸发器（东京理化器械株式会社）;离心机（株式会社日立制作所）;均质器（IKAT18）;旋涡混合器（德国IKA公司）;pH计（梅特勒—托利多集团）;恒温水浴振动器（常州国华电器有限公司，SHA-B）;氮吹仪（郑州安晟科学仪器有限公司）。

1.3 水解和衍生

准确称取制备均匀的鲫鱼样品2.00 g（精确至0.01 g）于 50 mL 离心管中，加入10 mL 0.2 mol/L盐酸溶液，加入适量内标标准溶液（100 μL 100 mmol/L 2-硝基苯甲醛溶液），旋涡均匀，放入37 ℃水浴避光振荡16 h。

1.4 提取净化

将水解衍生完成的样品取置室温，于离心管中加入 1.5 mL 1 mol/L磷酸氢二钾溶液，并用3 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～7.5间。10 000 r/min离心5 min，上清溶液转移至另一离心管中并加入10 mL乙酸乙酯，高速涡旋振荡 1 min，再次10 000 r/min离心5 min，取乙酸乙酯层于 15 mL 离心管中，40 ℃氮气吹干。准确加入1.0 mL甲醇-水溶液（体积比为8 ∶ 2），2 mL正己烷，涡旋振荡30 s，取下层溶液于 1.5 mL EP管中，15 000 r/min离心10 min，定容液经 0.22 μm 微孔滤膜过滤，于进样瓶中待测。

标准品采用与样品相同方法处理后待测。

1.5 色谱-质谱条件

1.5.1 液相条件 色谱柱：C18，10 cm×5 μm×0.21 mm（Thermo）;柱温：30 ℃;流速：250 μL/min;进样量：10 μL;流动相：甲醇/5 mmol/L乙酸铵溶液（0.1%甲酸）。

1.5.2 质谱条件 离子源温度（配备ESI源）：350 ℃;喷雾电压：4 500 V;鞘气：40arb;辅助气：10arb;硝基呋喃代谢物的离子参数见表1。

1.6 AOZ在鲫鱼中的代谢试验

配制含AOZ 2 mg/kg浓度饲料，鲫鱼苗体长约4 cm，养殖水温为（20±2） ℃，养殖密度为30尾/m3，投喂量为3%，每天投喂2次（上午、下午各1次），投喂时间为5 d。养殖密9度和饲料粒径随鲫鱼增长进行调整。投喂结束后2、4、6、12 h，1、2、4、8、16、20、30、40、60、90、120 d取样测定鲫鱼肉中AOZ残留量。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

取2.0 mg/L标准品，由蠕动泵进入质谱，离子源切换到正离子模式，调试离子源的喷雾电压，观察硝基呋喃化合物Full Scan模式下母离子的响应情况，确定喷雾电压、鞘气和辅助气流量;在MRM模式下自动扫描，确定响应最高、最稳定的碰撞能量，由此确定该方法的质谱条件，参数见表1。2 μg/L 浓度混合标准品参考图谱（图1）。在优化的质谱条件下，4种硝基呋喃代谢物8 μg/L浓度混合标准品分离度合理，峰形对称且峰形良好，并且在仪器上表现出良好的响应，灵敏度高，在此条件下可以进行4种硝基呋喃代谢物的分离测定。

2.2 液相条件的优化

根据硝基呋喃类药物性质及质谱条件，采用乙腈或甲醇作为有机相，0.1%甲酸和5 mmoL/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）作为水相。根据调试，甲醇可更好地提高检测灵敏度和分离效果，水相中加入乙酸铵可提高离子化效率，以获得理想色谱峰，因此确定使用甲醇-5 mmoL/L乙酸铵溶液（含 0.1% 甲酸）做流动相，具体的流动相比例详见表2。

2.3 线性方程和检出限

配制浓度为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的混合标准曲线，以内标法定量绘制标准曲线，硝基呋喃化合物在0～20.0 μg/L浓度范围内响应呈线性关系（r2>0.99），以信噪比（S/N）=3及标准品浓度计算硝基呋喃类代谢物检出限，详见表3。

2.4 衍生条件的优化

2.4.1 2-硝基苯甲醛溶剂的选择 由于硝基呋喃类代谢物分子量小，HPLC-MS/MS直接测定响应不好，灵敏度低，因此一般对其衍生化后再进行测定，常用衍生化试剂是2-硝基苯甲醛[14]。2-硝基苯甲醛常用二甲亚砜[10-11]和甲醇[12]溶解。试验过程中衍生浓度2 μg/L混合标准品，分别使用甲醇和二甲亚砜溶解，2-硝基苯甲醛作为衍生化试剂，详见表4。由结果可知，甲醇和二甲亚砜溶解的衍生化试剂对结果并无太大影响，考虑二甲亚砜易渗入皮肤，低温易凝固的特点，本试验采用甲醇溶解2-硝基苯甲醛。

2.4.2 衍生方式的选择 根据目前硝基呋喃代谢物检测标准，衍生方式有避光衍生[10-11]和直接衍生[12]，本试验对 2 μg/L 标准品分别进行避光衍生和直接衍生，结果见表5。由于硝基呋喃类药物代谢快速且对光敏感[15]，所以进行避光衍生。

2.5 提取条件的优化

2.5.1 离心速率影响 通常硝基呋喃类药物在提取时采用4 000 r/min离心[10-11]，但对于蛋白和脂肪含量高的样品，在此速率下即使离心10 min，离心管上层仍漂浮有杂质，另外用乙酸乙酯提取时，也易出现乳化现象，若分离不完全，对于检测结果会造成一定影响。提高离心速率对这类现象有明显改善，离心速率越高效果越好，因此本试验在分离和提取过程中皆采用10 000 r/min离心分离。氮吹后，采用正己烷除脂后易出现定容液与正己烷乳化现象，在15 000 r/min下离心 10 min，可使正己烷漂浮于上层，可彻底除去提取的脂肪，降低样品基质干扰。

2.5.2 乙酸乙酯提取次数的影响 农业部781号公告-4-2006[10]和GB/T 21311—2007《动物源性食品中硝基呋喃类代谢残留量监测方法》[12]标准方法中乙酸乙酯皆提取2次。因硝基呋喃类药物采用内标法进行定量，通过质控样品分析发现，乙酸乙酯提取1次，硝基呋喃类药物的回收率和相对标准偏差均在范围内，详见表6。因此采用1次提取法，不仅可简化提取步骤，还可减少试剂使用。

2.6 回收率试验

取阴性鲫鱼肉样，分别加入硝基呋喃类标准品，使添加浓度分别为0.5、1.0、5.0 μg/L，每个浓度6个平行样品，测其回收率及相对标准偏差。由表6可知，本方法4种硝基呋喃类代谢物的回收率均为91.7%～98.5%，相对标准偏差（RSD）为1.87%～6.93%，回收率和相对标准偏差均符合标准要求。

2.7 AOZ在鯽鱼内的代谢规律

由图2可知，AOZ在鲫鱼中投喂结束后0～6 h，AOZ含量呈上升趋势，在 6 h时测得最高含量为218.25 μg/kg，在 6～96 h 间AOZ残留量下降趋势明显，之后呈缓慢下降趋势，直至120 d后在鲫鱼中无AOZ检出。这与谭志军等研究呋喃唑酮对大菱鲆内的代谢规律[16]和刘书贵等研究呋喃唑酮在杂交鳢（斑鳢♀×乌鳢♂）体内残留消除规律[17]有相似之处。据食品药品监督管理局的食品安全抽查结果显示，当前水产品中呋喃唑酮仍时有检出，说明仍存在违禁使用现象。本试验结果显示，AOZ在鲫鱼体内代谢消除仍然非常缓慢，如果违禁使用还是存在很大风险。

3 结论

本研究建立了以盐酸溶液衍生提取，乙酸乙酯萃取，经液相色谱-串联质谱测定，并以对应同位素内标定量的硝基呋喃类代谢物残留测定方法。方法准确度高、精密度好、符合残留检测要求。通过对饲喂鲫鱼中AOZ残留消除规律的研究发现，AOZ在本试验条件下，120 d后鲫鱼中AOZ残留完全消除。如果试剂使用剂量大或时间长，消除时间还可能更长，因此违禁使用AOZ存在很大风险，这为硝基呋喃类药物的监管提供了一定试验依据。

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