何少忠（通信作者），张冬冬，王群，朱胜楠，毛亚婷，廖桂祥（通信作者）

1深圳宝安中心医院（深圳大学第五附属医院）肿瘤科 （广东深圳 518102）；2桂林医学院附属医院肿瘤科 （广西桂林 541004）；3深圳市人民医院放疗科 （广东深圳 518020）

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤,其发病率居女性恶性肿瘤首位[1]。肿瘤微环境对于乳腺癌的发生、发展有着至关重要的作用，肿瘤微环境中的T淋巴细胞和肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）备受关注。T淋巴细胞是肿瘤微环境中主要的免疫效应细胞，TAM是肿瘤免疫微环境中最丰富的免疫细胞，抑制T细胞免疫功能，在促进肿瘤进展与免疫逃逸中发挥关键的桥梁作用[2-3]。尽管人们对T细胞和TAM开展了广泛的研究，但是目前少有研究报道T细胞和TAM在乳腺癌组织的浸润与乳腺癌Ki-67表达及临床病理的关系[3]。本研究通过收集初治乳腺癌患者术后组织标本，采用免疫组织化学方法检测T淋巴细胞、CD68+TAM的浸润数量和乳腺癌Ki-67的表达，探讨乳腺癌组织中T淋巴细胞和CD68+TAM的浸润与乳腺癌增殖指数Ki-67表达及临床病理的相关意义。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源

收集桂林医学院附属医院2014－2018年初治乳腺癌术后石蜡组织标本45例，并与正常乳腺组织对比，乳腺癌患者术前未行放疗、化疗及内分泌等新辅助治疗。年龄35～75岁，中位年龄51岁；肿块直径，24例≤3 cm，21例＞3 cm；组织学分级，Ⅰ～Ⅱ级30例，Ⅲ级15例；淋巴结转移，25例未转移，20例转移；ER阴性18例，ER阳性27例；PR阴性17例，PR阳性28例；HER2阴性27例，HER2阳性18例。

1.2 主要试剂

鼠抗人单克隆抗体CD3、CD68、Ki-67（美国Invitrogen公司），免疫组织化学试剂盒与辣根过氧化物酶标记型的山羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物公司）。

1.3 T淋巴细胞、CD68+ TAM和Ki-67蛋白检测

运用免疫组织化学法检测乳腺癌组织中T淋巴细胞、CD68+TAM和Ki-67蛋白的表达。组织标本经4%的多聚甲醛固定液固定，后行脱水、石蜡包埋，4 μm连续切片。二甲苯脱蜡，再梯度乙醇水化，柠檬酸缓冲液进行抗原修复后，用3%的过氧化氢溶液浸泡10 min以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，5% BSA 37 ℃恒温箱孵育30 min。分别滴加鼠抗人CD3、CD68、Ki-67单克隆抗体（美国Invitrogen公司，工作液，无需稀释），湿盒内室温孵育1 h。经PBS洗3次后，滴加即用型二抗工作液，室温20 min，PBS洗3次，采用吐温20润洗1次，DAB显色。苏木素复染，脱水封片。用已知CD3、CD68、Ki-67染色阳性的扁桃体组织切片为阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 T淋巴细胞、CD68+ TAM结果判读和计数

CD3+染色结果评估：以细胞膜上有黄色和棕黄色染色的T淋巴细胞为阳性细胞。CD68+染色结果评估：以细胞浆有黄色和棕黄色的巨噬细胞为阳性细胞。由2名病理科医师观察免疫组织化学切片，每个片子均在显微镜高倍镜视野下（×400）随机选取5个表达比较集中的视野，对整个区域进行计数，最后取5个视野总和的平均值；以中位值为标准分为高低表达组，高于中位值为高表达组，低于中位值为低表达组。

1.5 Ki-67的结果评估和表达测定

Ki-67表达于肿瘤细胞，胞核染色呈棕黄色。每张切片选取5个高倍视野，显微镜下计数1 000个肿瘤细胞，计算胞核染色细胞所占比例，取其平均值为Ki-67增殖指数，Ki-67以百分率为计量指标。

1.6 评价指标

CD3+、CD68+和Ki-67均通过免疫组化所着色的颜色强度与着色的颗粒数量来评价阳性、阴性及表达强度。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 T淋巴细胞、CD68+ TAM和Ki-67在乳腺癌中的表达

CD3+在组织切片中定位于T淋巴细胞的细胞膜，阳性细胞呈弥漫状分布在乳腺癌癌间质，亦有呈卵圆形散在浸润于乳腺癌癌巢（图1）；CD68+在组织切片中定位于巨噬细胞的细胞浆，阳性细胞呈巢状分布在乳腺癌癌间质，亦有呈星形散在浸润于乳腺癌癌巢（图2）。Ki-67在组织切片中定位于肿瘤细胞的细胞核，细胞呈椭圆形散在分布于乳腺癌癌巢（图3）。

图1 T淋巴细胞在不同乳腺组织中的表达

图2 CD68+ TAM在不同乳腺组织中的表达

图3 Ki-67在不同乳腺组织中的表达

2.2 乳腺癌浸润的T淋巴细胞、CD68+ TAM与乳腺癌增殖指数Ki-67的关系

分别收集T淋巴细胞、CD68+TAM与Ki-67共3组数据，这3组数据的总体表达水平分别为（162.20±27.99）个/HPF、（87.36±10.72）个/HPF和（30.31±19.97）%（图4）。T淋巴细胞与CD68+TAM阳性表达中位值为别为167个/HPF、86个/HPF；将T淋巴细胞数≤167个/HPF定为低表达组，T淋巴细胞数＞167个/HPF定为高表达组（图5）；CD68+TAM数≤86个/HPF定为低表达组，CD68+TAM数＞86个/HPF定为高表达组（图6）。

图4 T淋巴细胞、CD68+TAM与Ki-67的总体表达水平

图5 T淋巴细胞中位值

图6 CD68+ TAM的中位值

T淋巴细胞浸润高表达组与低表达组的14%、20%、30%Ki-67增值指数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；T淋巴细胞浸润高表达组与低表达组的50%Ki-67增殖指数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。CD68+TAM浸润高表达组与低表达组的14%、20%、30%、50%Ki-67增值指数比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 CD3+T淋巴细胞、CD68+TAM浸润与Ki-67不同增殖指数的关系

2.3 T淋巴细胞、CD68+ TAM浸润与乳腺癌患者临床病理参数的关系

T淋巴细胞浸润程度与乳腺癌肿块大小、淋巴结转移、ER及PR有关（P＜0.05）；CD68+TAM浸润程度与乳腺癌患者年龄、淋巴结转移及HER2有关（P＜0.05）。见表2和图7。

3 讨论

肿瘤免疫微环境对乳腺癌的演进起了关键作用[2]。T淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞的主要细胞类型，表达特异性抗原CD3，能直接杀死肿瘤细胞和纠正身体免疫功能低下，在肿瘤免疫治疗中起主导作用。但是T淋巴细胞在肿瘤微环境中处于被抑制状态，导致肿瘤浸润T淋巴细胞减少、活性低。因此，T淋巴细胞的功能正常和数量稳定是微环境内细胞免疫功能正常发挥的首要条件[3-4]。浸润于实体肿瘤内部和周边的巨噬细胞被称为TAM。TAM是外周血单核细胞迁移浸润到肿瘤组织的巨噬细胞，是肿瘤免疫微环境中最丰富的免疫细胞，在促进肿瘤进展与免疫逃逸中发挥关键的桥梁作用[5]。TAM表面表达多种特异抗原，如CD68、CD163等。TAM在乳腺癌浸润免疫细胞中的比例高达50%，促进乳腺癌的发生、发展，导致乳腺癌复发及预后不良，越来越受到研究人员的重视[6]。

表2 T淋巴细胞、CD68+TAM浸润与乳腺癌临床病理参数的关系

图7 T淋巴细胞、CD68+TAM浸润与乳腺癌临床病理参数的关系

CD3+是所有成熟T细胞上存在的一种糖蛋白受体，表达于成熟T细胞表面，在组织内代表总的T淋巴细胞[7]。T淋巴细胞是炎症反应的重要细胞，也是肿瘤免疫的主要效应细胞，能识别并杀伤肿瘤细胞。研究发现，在乳腺癌组织内T淋巴细胞在癌间质和癌巢内大量分布，提示肿瘤细胞正式启动了细胞免疫应答机制，这也预示着随着T淋巴细胞的数量在肿瘤周围大量聚集，阻碍肿瘤细胞的增殖，延缓了肿瘤的进展[8]。CD68+是一种主要表达于单核-巨噬细胞系统的胞浆蛋白，表达于巨噬细胞表面，在组织内代表总的TAM[9]。近年来，多项研究表明，TAM在肿瘤微环境中有促进肿瘤血管生成和细胞增殖的作用，从而促进肿瘤的进展[10-11]。根据巨噬细胞的活化类型及其在肿瘤微环境中的不同作用，主要将其分为两种极化类型，即经典活化的M1型和替代性活化的M2型。M1型主要诱导Th1型免疫应答，释放大量细胞因子，如ROS、NO等，产生细胞毒作用杀伤肿瘤；M2型主要诱导Th2型免疫应答，特征性表达CD163、CD206，抑制炎症促进肿瘤生长[12-13]。在Mohammed等[14]研究中，乳腺癌癌间质中T淋巴细胞与TAM大量浸润，分别扮演着阻碍和促进肿瘤细胞的进展作用。本研究结果显示，乳腺癌浸润T淋巴细胞越少，Ki-67增值指数越高；乳腺癌浸润CD68+TAM越多，Ki-67增值指数也越高。Ki-67是判断肿瘤细胞处于增殖期的生物标志，能准确地反映肿瘤细胞的增殖活性[15]，表达于细胞核的非组蛋白，伴随着肿瘤的增殖、侵袭及转移等过程。本研究结果显示，T淋巴细胞浸润数量与乳腺癌肿块大小、淋巴结转移、ER和PR密切相关；CD68+TAM浸润数量与乳腺癌患者年龄、淋巴结转移和HER2有关。随着乳腺肿块的增大及淋巴结的受累等，T淋巴细胞浸润数量明显减少，而CD68+TAM浸润明显增加。

综上所述，乳腺癌癌间质中浸润的T淋巴细胞和CD68+TAM与乳腺癌患者Ki-67蛋白表达显著相关。不仅如此，T淋巴细胞的数量分布还与肿块大小、淋巴结转移及ER、PR有关，CD68+TAM的浸润数量与患者年龄、淋巴结转移及HER2差异显著。因此，乳腺癌浸润的CD68+TAM与乳腺癌的进展密切相关，可用来预测乳腺癌的生物学行为以及乳腺癌免疫治疗的潜在干预靶点，并进一步深入研究相关分子机制。