徐静 李传杰 王亮亮 刘标 高晓冬 冉斌

为防止进展为失代偿期肝硬化甚至肝功能衰竭、肝癌，临床必须对乙肝肝硬化代偿期患者进行抗病毒、抗纤维化治疗。虽然积极抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)治疗能够明显延缓肝脏疾病进程、减少终末期肝病的发生，但临床治疗效果的个体化差异大，有学者认为与机体维生素D(Vitamin D，VitD)3缺乏有关[1]。事实上，近年来VitD代谢在慢性肝脏疾病中的作用越来越受到重视，有横断面调查[2]显示慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、原发性肝癌患者的VitD3水平缺乏程度依次加重。故VitD3联合抗病毒成为了乙肝肝硬化治疗新的研究方向。为此，本研究拟创新性研究，分析VitD3联合恩替卡韦抗病毒治疗对乙肝肝硬化代偿期患者外周血T淋巴细胞水平、肝功能及肝硬化相关指标等的影响。

资料与方法

一、临床资料

以2016年7月—2017年10月期间本院肝病科住院及门诊治疗的100例乙肝肝硬化代偿期患者为研究对象，按入院顺序给予编号后，以随机数字表法分为研究组与对照组，各50例，两组各项基线资料对比无统计学意义(P>0.05)，见表1，认为均衡可比。本研究符合本院伦理委员会及卫生部医学科研管理研究所确定的人体实验伦理原则的相关要求。病例入选标准：(1)年龄20～65岁；(2)均为乙肝肝硬化代偿期初治患者，符合中华医学会肝病学分会2010年拟定的相关诊断标准[3]；(3)对本研究目的和意义知情且同意；(4)临床各项资料完善。排除标准：(1)失代偿期肝硬化、肝癌；(2)酒精性、药物性、自身免疫及其他肝炎病毒重叠感染等引起的代偿期肝硬化；(3)合并肝脏以外的其他脏器功能障碍；(4)伴随甲亢、自身免疫性疾病、严重器质性疾病、凝血功能障碍、精神疾病；(5)入选前接受过干扰素或胸腺肽等免疫治疗及近半年内服用过VitD相关药物；(6)治疗依从性差或因各种原因不能完成整个治疗过程。

表1 两组基线资料比较(n，±s)

二、治疗方法

对照组患者仅给予抗HBV治疗，口服恩替卡韦片(国药准字H20052237，中美上海施贵宝制药有限公司，规格0.5 mg)0.5 mg/次，1 次/d。治疗期间适当给予保肝药物治疗。研究组患者给予VitD3联合抗HBV治疗，即在对照组基础上口服骨化三醇胶丸(国药准字H20030491，青岛正大海尔制药有限公司，规格0.25 μg/粒)1粒/次，1次/d。两组患者均连续服用48周后评估结果。

三、观察指标

治疗前，治疗48周后分别采集两组患者空腹外周静脉血4 mL，3 000 r/min(离心半径15 cm)离心处理10 min，分离血清于-80℃冰箱贮存备测。(1)采用FQ-PCR及基因荧光定量分析仪检测血清HBV DNA水平，以HBV DNA拷贝数<103拷贝/mL为转阴；(2)采用电化学发光法检测血清25-羟维生素D3[25-hydroxy vitamin D3，25-(OH)D3]水平；(3)采用流式细胞法检测外周血T淋巴细胞水平，包括CD3+、CD4+、CD4+/CD8+；(4)采用全自动生化分析仪检测肝功能指标，包括总胆红素(total bilirubin，TBil)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)；(5)采用放射免疫法检测血清肝纤维化指标水平，包括透明质酸酶(hyaluronidase，HA)、层黏连蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型胶原(type IV collagen，ⅣC)、Ⅲ型前胶原(type Ⅲ procollagen，PCⅢ)。此外，密切观察治疗期间及随访了解治疗结束后不良反应发生情况。

四、统计学方法

结 果

一、两组治疗前后血清HBV DNA、25-(OH)D3水平比较

两组治疗前血清HBV DNA、25-(OH)D3水平对比无统计学意义(P>0.05)，治疗后血清HBV DNA水平均显著下降(P<0.05)，但对照组血清25-(OH)D3水平未见改善(P>0.05)，研究组血清25-(OH)D3水平明显升高(P<0.05)，且研究组治疗后血清HBV DNA、25-(OH)D3水平与对照组相比存在显著性差异(P<0.05)，见表2。

表2 两组治疗前后血清HBV DNA、25-(OH)D3水平比较(±s)

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

二、两组治疗前后外周血T淋巴细胞水平比较

两组治疗前外周血T淋巴细胞水平比较无统计学意义(P>0.05)，治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均明显升高(P<0.05)，但研究组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平显著高于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 两组治疗前后外周血T淋巴细胞水平比较(±s)

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

三、两组治疗前后肝功能指标比较

两组治疗前肝功能指标水平比较无统计学意义(P>0.05)，治疗后TBil、AST、ALT水平均明显降低(P<0.05)，但研究组TBil、AST、ALT水平显著低于对照组(P<0.05)，见表4。

表4 两组治疗前后肝功能指标水平比较(±s)

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

四、两组治疗前后血清肝纤维化指标水平比较

两组治疗前血清肝纤维指标比较无统计学意义(P>0.05)，治疗后HA、LN、ⅣC、PCⅢ水平均明显降低(P<0.05)，且研究组HA、LN、ⅣC、PCⅢ水平显著低于对照组(P<0.05)，见表5。

表5 两组治疗前后血清肝纤维化指标水平比较(±s)

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

五、不良反应统计

两组患者治疗期间均未见严重不良反应，研究组共出现轻微不良反应7例(14.00%)，包括头晕3例、恶心3例、血肌酐升高1例；对照组共出现轻微不良反应5例(10.00%)，包括头晕3例、恶心1例、血肌酐升高1例。两组不良反应率无统计学差异(χ2=0.379，P>0.05)。

讨 论

越来越多文献[4-5]指出，单独给予抗HBV治疗来抑制DNA复制，疗效存在明显的个体化差异，尤其在改善患者免疫功能及缓解肝纤维化方面均存在一定的局限性。外周血T淋巴细胞亚群介导适应性细胞免疫应答，临床上常视为机体免疫功能状态的指标，尤其是病毒特异性T细胞的免疫反应在肝脏病理与病毒清除过程中扮演着效应、调节的角色。CD4+T细胞(即CD3+CD4+CD8-T细胞)、CD8+T细胞(即CD3+CD4+CD8+T细胞)代表两类主要的T细胞亚群，二者通过分泌不同的细胞因子发挥不同的免疫效应，当机体应答异常时，T细胞百分比发生变化，而CD4+/CD8+值可直接反映机体免疫功能有无紊乱[6]。研究显示[7]，与正常人相比，肝硬化患者各亚群及其分泌的细胞因子的动态平衡状态被打破，且部分抗HBV治疗药物甚至可能加重这种免疫调节失衡。同时，肝纤维化是肝硬化患者肝脏纤维组织增生和肝脏受到损伤的一种愈合反应，其与肝内微循环受阻、受损肝细胞修复障碍密切相关，因此被认为是影响患者预后的重要环节。陈琼等[8]的研究证实HBV载量与血清肝纤维化学指标HA、LN、ⅣC、PCⅢ存在相关性。

更重要的是，临床学者一致认为外周血T淋巴细胞水平变化、肝纤维化程度均与患者机体VitD3缺乏有关，如欧阳福等[9]指出，VitD主要以调节T淋巴细胞功能为主，通过作用于抗原提呈细胞、系列细胞因子而诱导T淋巴细胞的增殖，即VitD可参与乙肝肝硬化患者免疫功能调节，并通过严谨的临床分析证实血清25-(OH)D3与 CD3+T细胞呈正相关；钟燕明等[10]的报道与之类似；柯昌征[11]、陈思宇等[12]的研究则证实VitD缺乏与乙型肝炎患者肝功能损伤、肝纤维化程度密切相关，可能原因为VitD可在肠道微生态与抗感染免疫中发挥作用。因此，Mahamid等[13]的早期研究就曾指出VitD补充可能在HBV感染者的病情控制中发挥重要作用。王家健等[14]的基础研究将25只肝损伤小鼠随机分为正常组、模型组、VitD3低、中、高剂量干预组，发现VitD3高剂量组和中剂量组的肝脏指数和血清ALT、AST的水平则显著低于模型组，各VitD3干预组小鼠肝脏HE染色及超微结构的改善情况均明显优于模型组，由此证实VitD3对四氯化碳诱导的急性肝损伤小鼠肝脏超微结构具有保护作用。此外，何小敏等[15]的单因素和多因素分析结果显示高HBV DNA水平是乙型肝炎抗病毒治疗耐药发生的危险因素(OR=3.064)，高水平VitD3却可减少耐药性的发生(OR=0.920)，认为对慢性乙型肝炎使用抗病毒治疗患者应关注其VitD3水平，以便早期进行更好的针对性干预及减少耐药性发生。基于以上分析，本研究对比分析单独恩替卡韦抗HBV治疗、VitD3联合抗HBV治疗的效果，发现后者不仅仅血清HBV-DNA、25-(OH)D3水平改善效果更突出，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平升高，TBil、AST、ALT、HA、LN、ⅣC、PCⅢ水平降低效果更优，证实VitD3联合恩替卡韦治疗可有效增强乙肝肝硬化代偿期患者机体免疫、改善肝功能及延缓肝纤维化进程，且补充VitD3不会增加用药安全问题。因此，认为VitD3联合恩替卡韦治疗安全可行。本结论仍需扩大样本量、多中心的研究论证。