王振宇 李伟建 张洪丹 景宏舒 袁天杰 彭媛 鄢和新 翟博

HepG2细胞是一种已经被广泛表征的人肝癌细胞系，具有诸如容易大量获取，易处理和无限寿命等优点，是最常用的肝细胞模型；然而，HepG2较低的肝细胞功能，在一定程度上妨碍了其的应用[1]。

研究报道，一些特定小分子具有改善肝细胞功能，促进细胞分化的作用，采用含有特定小分子组合的肝细胞成熟培养基(HMM)可成功将肝细胞衍生的肝祖细胞样细胞(HepLPC)分化为成熟肝细胞[2-6]。本研究观察了这种新型肝细胞成熟培养基对HepG2的作用，并以此为基础建立新的三维HepG2培养体系，旨在降低因HepG2低功能带来的不利影响，更好的服务于相关研究。

资料与方法

一、 细胞培养

冷冻保存的HepG2细胞系购自中国科学院(上海)细胞库。37℃水浴解冻后，将细胞培养在含有10%胎牛血清(Biological Industries)和1%青链双抗(源培生物科技股份有限公司)的DMEM(源培生物科技股份有限公司)中，然后将细胞置于37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中进行培养。每2～3天更换一次培养基，细胞覆率超过80%时使用0.25%的胰酶(源培生物科技股份有限公司)进行消化，并按照1∶3～6的比例接种入新的培养皿中。

二、 HepG2的2D功能提升培养

将状态良好的HepG2接种在细胞培养板中，并在DMEM完全培养基中培养1～3 d直至细胞覆率达到60%～80%。然后将培养基更换为肝细胞成熟培养基(HMM)[5-6]。另外培养7～9 d以诱导HepG2的功能提升。HMM基于DMEM/F12，补充有N2和B27(均购自源培生物科技股份有限公司),10 μmol DAPT(TargetMol)，20 ng/mL OSM(Peprotech)，10 μmol地塞米松(Sigma-Aldrich)，10 μmol SB431542(TargetMol)。培养基每2～3天更换1次，诱导前后的显微照片使用Nikon Ta2-FL捕获。

三、 HepG2的3D功能提升培养

将状态良好的HepG2以1～2×106每孔的数量接种入6孔低黏附板(CORNING)。细胞最初培养于DMEM完全培养基中，24～48 h形成稳定的3D结构。之后，将培养基更换为HMM培养7～9 d，以进一步提升肝功能。 培养基每2～3天更换1次。

四、 实时荧光定量PCR

使用Trizol试剂(碧云天生物科技有限公司)提取总RNA，使用BeyoRTTMIII cDNA第一链合成试剂盒(碧云天生物科技有限公司)合成cDNA。 通过使用ABI 7 300PLUS实时PCR仪(Life Technologies)和SYBR Green qPCR Mix(2X，High ROX)(碧云天生物科技有限公司)进行QPCR分析。使用ΔΔCt方法分析基因转录数据并归一化到管家基因18s。 引物由上海华津生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

五、过碘酸-希夫染色

使用南京建成生物工程研究所的糖原染色试剂盒进行过碘酸-希夫染色以检测糖原合成情况，染色完成后使用Nikon Ta2-FL拍摄显微图像。

六、尿素检测

在含有3 mmol NH4Cl的HMM中培养2D及3D培养物。NH4Cl诱导后24 h收集上清液。QuantiChromTM尿素测定试剂盒(BioAssy Systems，USA)检测尿素浓度。 所有数据均经过时间和总蛋白量校正。

七、氯丙嗪毒性检测

将1×106的HepG2细胞接种在384孔微球板中(CORNING)，并以200×g离心3 min。 接种2～3 d后，将50%的培养基更换为HMM或者新鲜的DMEM完全培养基。之后，每隔1天更换50%的培养基。培养9 d后，将细胞球暴露于一定浓度梯度的氯丙嗪中，暴露48 h后，使用PrestoBlueTMCell Viability Reagent(Invitrogen)定量细胞活力。毒性结果总结为归一化的剂量依赖性毒性曲线和50%毒性浓度(TC50)值。

八、统计学处理

通过GraphPad Prism 7软件进行统计学分析，采用student’st检验，P<0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列

结 果

一、 HMM明显提高了HepG2的肝细胞功能

相对于DMEM培养的HepG2细胞(HepG2-2D-DMEM)，HMM培养7 d的HepG2细胞(HepG2-2D-HMM)形态明显改变，表现为细胞增大，细胞内出现多个细胞核，胞质内颗粒丰富(图1 A,B)。PAS检测显示HepG2-2D-HMM相对于HepG2-2D-DMEM呈明显阳性结果(图1 C,D)，表明细胞合成糖原的能力明显增强。

注：A. DMEM培养的HepG2;B.与HMM培养的HepG2；C. DMEM培养的HepG2的PAS;D. HMM培养的HepG2的PAS

图1HMM培养HepG2前后的形态及PAS改变

对于5种主要肝细胞功能基因的QPCR显示HMM明显提高了HepG2的肝细胞功能基因的表达(表2)。其中，相对HepG2-2D-DMEM，HepG2-2D-HMM的主要药物代谢酶CYP3A4表达上调4.7±0.18倍(t=18.6,P<0.01)；HBV受体NTCP表达上调1.3±0.1倍(t=8.929，P<0.01)；氨解毒及尿素循环关键酶CPS1表达上调4.9±0.2倍(t=19.36，P<0.01)；血浆蛋白Alb表达上调1.4±0.1倍(t=5.708，P<0.05)；糖异生关键酶G6PC表达上调5.6±0.1倍(t=13.14，P<0.01)。

二、HMM联合3D培养提升HepG2的肝细胞功能

为了进一步提升HepG2的肝细胞功能，建立了HMM联合3D培养的HepG2培养体系(HepG2-3D-HMM)。悬浮在6孔低黏附板内的单个HepG2细胞在6～12 h内开始聚集，并在24～48 h内形成比较稳定的3D结构(图2)，随后继续使用HMM培养7 d以提高细胞功能。尿素产生检测显示，相对于HepG2-2D-HMM，HepG2-3D-HMM的尿素合成能力大幅提升，由HepG2-2D-HMM的0.20±0.04 μg/mg protein/day提升到HepG2-3D-HMM的(88±20) μg/mg protein/day，差异有统计学意义 (t=4.475,P<0.05)。

图2 HepG2-3D-HMM的显微照片

对于5种主要肝细胞功能基因的QPCR揭示了肝细胞功能基因表达水平的进一步提升(表2)。结果显示，在这5种基因的表达情况中，除Alb外(t=1.024，P=0.41)，CYP3A4(t=9.176，P<0.05)、NTCP(t=30.76，P<0.01)、CPS1(t=6.371，P<0.05)、G6PC(t=64.27，P<0.01)均获得明显改善。

三、 HMM有利于更准确的预测肝毒性药物

与3D环境下使用DMEM培养的HepG2细胞(HepG2-3D-DMEM)相比，HepG2-3D-HMM对氯丙嗪急性肝毒性的敏感性大幅提高(图3)。尽管HepG2-3D-HMM对氯丙嗪的TC50(85±7)μmol/L与原代肝细胞对氯丙嗪的TC50(25±5)μmol/L有一定差距(t=10.91,P<0.01)，但仍显著优于HepG2-3D-DMEM对氯丙嗪的TC50(254±36)μmol/L(t=7.982,P<0.01)，这表明HMM显著改善了HepG2对于氯丙嗪毒性的预测能力。

表2 HepG2-2D-HMM及HepG2-3D-HMM相对HepG2-2D-DMEM的肝功能基因表达量

注：与HepG2-2D-DMEM相比，at=18.6,bt=8.929,ct=5.708,dt=19.36,et=13.14； 均P<0.05。与HepG2-2D-HMM相比，ft=9.176,gt=30.76,ht=1.024,it=6.371,jt=64.27; 除hP=0.41外, 余均P<0.05

讨 论

肝细胞广泛用于多种领域，然而，原代人肝细胞的诸多缺陷严重限制了其应用。作为目前使用最广泛的永生肝细胞模型之一，HepG2肝癌细胞系已用于药物诱导的肝毒性评估[1]。然而，HepG2细胞系的药物代谢基因表达水平低下[1]。为了克服这个缺点，我们开发了一种肝细胞成熟培养基(HMM)，前期工作表明，HMM可以快速将肝细胞来源的肝祖细胞样细胞(HepLPCs)分化成成熟的肝细胞[5, 6]。在本研究中，HMM被证明能够快速诱导HepG2的功能提升。与DMEM培养的HepG2相比，HMM培养的HepG2一方面表现出更接近成熟肝细胞的形态、更强的糖原合成能力，另一方面其多个肝细胞基因表达水平，特别是代谢了超过1/3的药物的CYP3A4的基因表达水平，同样得到显著提升。这无疑会在一定程度上缓解HepG2较低的肝细胞功能带来的影响。

越来越多的证据表明，在3D环境中培养细胞可以显着改善其肝功能[7，8]，尽可能的模拟体内肝脏复杂性一直被认为是再生医学，药物开发和生物技术领域的主要挑战[9]。本研究联合3D培养及HMM诱导，建立了HepG2-3D-HMM模型。所得的HepG2-3D-HMM，相对于HepG2-2D-HMM，多个肝细胞基因表达水平明显得到提高。为了进一步验证HMM在HepG2的3D培养物中的重要作用，对比了HepG2-3D-HMM以及HepG2-3D-DMEM对已知肝毒性药物氯丙嗪的48 h急性肝毒性的预测能力，结果显示，HMM显著改善了HepG2的3D培养物对氯丙嗪肝毒性的敏感性，其TC50更接近于文献报道的原代人肝细胞的TC50，因此HMM联合3D培养将极大的促进HepG2在制药工业中的应用并减少药物诱导肝损伤的发生率。除此之外，相对于HepG2-2D-HMM，HepG2-3D-HMM尿素合成能力的大幅提升，已经超过了文献中报道的几种生物人工肝常用细胞的尿素合成能力[10]。这说明其在生物人工肝方面应用的潜力。

综合上述，联合3D培养，所培养的HepG2细胞功能会进一步提升，使其更适于药物肝毒性筛查甚至是生物人工肝的建立。