班凌伟 谢东 于淑清

铁蓄积与肝损伤之间有着密切的联系。一方面，铁蓄积会导致或加重肝纤维化、肝细胞瘤，铁过负荷会增加脂质过氧化并易化细胞凋亡[1]；另一方面，很多肝脏疾病都伴随着铁蓄积现象的存在，在酒精性肝病和丙型肝炎中，肝脏铁蓄积是其常见的特性[2]。近年研究发现，在慢性活动性肝炎及肝硬化中，铁主要蓄积在肝小叶外周区，为肝库普弗细胞所吞噬，血色病患者的肝纤维化只发生在肝库普弗细胞中铁负荷过重的位置[3]，但是关于肝库普弗细胞铁蓄积与肝损伤关系的研究很少。因此，本课题通过对模型小鼠与正常小鼠注射CCl4造成急性肝损伤，来研究肝库普弗细胞铁蓄积是否会加重肝损伤，探讨肝库普弗细胞在其中发挥的作用，为进一步揭示铁蓄积与肝损伤的联系机制提供参考。

铁转运蛋白(Ferroportin，FPN)是目前唯一已知的铁输出蛋白[4]。肝库普弗细胞是分布于肝脏中的一种巨噬细胞，在铁离子代谢中，吞噬衰老的红细胞而获得铁离子，在FPN的作用下将铁离子转运出细胞[5]。巨噬细胞FPN敲除是利用Cre/loxP系统，使FPN只在小鼠巨噬细胞特异性敲除，使巨噬细胞铁无法转运出，造成巨噬细胞铁蓄积，而肝库普弗细胞是巨噬细胞的一种，因此本课题采用巨噬细胞FPN敲除小鼠作为肝库普弗细胞铁蓄积模型小鼠。CCl4作为经典的剧毒类亲肝毒物，对各种动物均可导致肝脏损伤，是常用的动物急性肝损伤模型[6]。

资料与方法

一、研究对象

雄性清洁级FPN-/-cre小鼠(肝库普弗细胞铁蓄积小鼠)和FPN-/-小鼠(正常小鼠)各16只，8周龄，体重(23～26)g。分别随机分为两组：FPN-/-cre小鼠对照组和实验组；FPN-/-小鼠对照组和实验组；每组8只。

二、实验方法

(一)CCl4急性肝损伤模型的建立：对照组：橄榄油5 μL/g；实验组：0.25% CCl45 μL/g；全部采用腹腔注射。

(二)标本的收集及肝匀浆的制备：禁食不禁水，24 h后称取小鼠体重；取血测定血清中ALT、AST水平；处死小鼠，称取完整肝脏重量，计算肝脏指数；取一部分肝组织制成10%肝脏组织匀浆，测定肝组织MDA、SOD、GSH含量。

(三)肝脏组织病理学观察：取较为规则的一部分肝组织，经过固定、包被、包埋、切片处理后，HE染色，显微镜进行观察。

三、统计学方法

结 果

一、小鼠肝脏指数、血清ALT、AST变化

两实验组肝脏指数、血清ALT、AST均高于其对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明经CCl4处理后，两组小鼠肝脏均增大，CCl4建模成功。两对照组肝脏指数、血清ALT、AST的差异无统计学意义(P>0.05)。FPN-/-cre实验组肝脏指数、血清ALT、AST高于FPN-/-实验组，差异有统计学意义(P<0.05)，因此在相同的CCl4处理下，FPN-/-cre小鼠比FPN-/-小鼠肝脏体积更大，肝损伤更严重。见表1。

表1 小鼠肝脏指数、血清ALT、AST比较(±s，n=8)

注：与FPN-/-对照组相比，aP<0.05；与FPN-/-cre对照组相比，bP<0.05；与FPN-/-实验组相比，cP<0.05

二、小鼠肝组织MDA、SOD、GSH变化

两实验组MDA水平均高于其对照组，SOD、GSH水平均低于其对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。经CCl4处理后，两种小鼠肝脏受到氧化损伤，CCl4建模成功。两对照组MDA、SOD、GSH水平差异无统计学意义(P>0.05)。FPN-/-cre实验组MDA水平高于FPN-/-实验组，差异有统计学意义(P<0.05)。FPN-/-cre实验组SOD、GSH水平低于FPN-/-实验组，差异无统计学意义(P<0.05)。在相同的CCl4处理下，FPN-/-cre小鼠比FPN-/-小鼠肝脏氧化损伤更严重，主要表现为MDA增加(见表2)。

表2 小鼠肝脏MDA、SOD、GSH比较(±s，n=8)(nmol/mgprot)

注：与FPN-/-对照组相比，aP<0.05；与FPN-/-cre对照组相比，bP<0.05；与FPN-/-实验组相比，cP<0.05

三、小鼠肝脏病理学情况

两对照组肝细胞结构完整、清晰，排列有序，胞浆致密，核大而圆，两组没有显著差异。FPN-/-实验组肝细胞结构破裂，排列紊乱，包浆出现松散。FPN-/-cre实验组肝细胞结构破裂、溶解，排列杂乱，包浆严重松散，局部还出现了出血点现象，是肝损伤的显著标志。说明在同样的CCl4处理下，FPN-/-cre小鼠比FPN-/-小鼠肝损伤更严重。见图1。

注：A为FPN-/-对照组，B为FPN-/-cre对照组，C为FPN-/-实验组，D为FPN-/-cre实验组

图1小鼠HE染色情况比较

讨 论

肝脏指数是肝脏毒性试验观察中的重要指标，肝脏指数越大，表明肝损伤越重[7]。当肝细胞受损变性、细胞膜通透性增加时，从细胞内溢出的主要是血清ALT，当肝细胞严重病变、坏死时，线粒体内的AST会释放到血液中。在铁蓄积影响肝损伤的实验研究中，大部分文献报道不同原因的肝脏铁蓄积均会使肝脏指数增大，血清ALT、AST水平升高，肝损伤加重[8]。本实验中，在相同的CCl4处理下，FPN-/-cre小鼠肝脏指数、血清ALT、AST水平显著性大于FPN-/-小鼠，说明与其他原因引起的肝脏铁蓄积一样，肝库普弗细胞铁蓄积同样会加重肝损伤。证实了肝库普弗细胞在铁蓄积与肝损伤关系中的重要性，也一定程度上解释了部分患者的肝纤维化只发生在肝库普弗细胞中铁负荷过重位置的现象。

很多机制推测解释铁蓄积影响肝损伤的原因，包括增加氧自由基，通过星状细胞激活纤维形成，损害免疫反应等。二价铁离子会与脂质过氧化物反应产生自由基，这些自由基会氧化各种细胞成分，导致细胞凋亡或其他细胞伤害，造成肝细胞损伤、肝纤维化

的发生。MDA是过氧化损伤的标志产物，其含量的高低可以灵敏的反映肝损伤强烈程度；SOD是一种存在于细胞液中的抗氧化酶，其活性的高低可间接反映机体抗氧化能力的强弱；GSH是细胞内重要的水溶性抗氧化剂，可清除O2-、H2O2等过氧化物[9]。在铁蓄积影响肝损伤的实验研究中，大部分文献报道铁蓄积会使小鼠肝脏MDA水平升高，SOD、GSH水平降低，肝脏氧化损伤加重[10]。本实验中，在相同的CCl4处理下，与FPN-/-小鼠相比，FPN-/-cre小鼠肝脏MDA水平升高，差异具有统计学意义，SOD、GSH水平降低，差异不具有统计学意义。说明与其他原因的铁蓄积影响肝损伤相比，肝库普弗细胞铁蓄积确实加重了肝脏的氧化损伤程度，主要表现为过氧化损伤产物MDA的生成增加，而抗氧化剂SOD、GSH的分泌无明显增加，可能是机体对过氧化物的清除作用尚无明显差异。在肝库普弗细胞铁蓄积加重肝损伤的过程中，铁的过氧化可能具有一定作用，但具体机制仍需进一步探讨。