吴晓静 姜劲峰 蒋 颖 李杰俊

南京中医药大学 江苏 南京 210019

一氧化氮（NO）参与了炎症反应过程，高表达一氧化氮合酶（iNOS）和NO过量产生是关节炎[1]、脓毒血症[2]等病症的病理环节。抗炎是灸法的普遍性效应规律[3]。我们前期的研究已经证明了TRPV1介导温和灸对于氟氏佐剂炎症模型的抗炎[4]和镇痛[5]中的作用。辣椒素（TRPV1激动剂）抑制LPS和IFN-γ介导的巨噬细胞表达iNOS和产生NO[6]；隔饼灸有效降低膝关节炎模型兔血清、关节滑液和软骨中的iNOS含量，减轻关节软骨损伤[7]。温和灸是否通过TRPV1介导影响了iNOS——炎症的普遍性环节？我们设计本研究试图回答该问题。总结汇报如下。

1 材料与方法

1.1 实验设计：本研究由两部分实验组成，分述如下。

1.1.1 实验一：“TRPV1拮抗剂影响温和灸对佐剂性关节炎症模型小鼠的抗炎效应及与iNOS的相关性”。利用辣椒平（TRPV1拮抗剂）阻断温和灸效应途径，观察辣椒平对温和灸抗炎效应及其iNOS的影响。

1.1.2 实验二：“温和灸对TRPV1-/-佐剂性关节炎症模型小鼠iNOS的影响”。对比观察温和灸对TRPV1-/-模型小鼠及其野生型小鼠抗炎作用、影响iNOS的差异。

1.2 动物及分组：分述如下。

1.2.1 实验一：健康成年昆明（KM）雄性小鼠50只，体重35±2g（上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号2007000547161），随机分为5组：正常组、模型组、温和灸组、辣椒平组、温和灸+辣椒平组，每组各10只。

1.2.2 实验二：C57BL/6野生型小鼠16只（体重16～20g）、J003770TRPV1基因敲除小鼠16只，体重17～20g（南京大学实验动物中心，合格证号20100001）。分组：C57BL/6野生型小鼠随机分为野生模型组和野生温和灸组，每组各8只。16只TRPV1基因敲除小鼠随机分为KO模型组和KO温和灸组，每组各8只。

1.3 造模：实验第1天，将20μl完全弗氏佐剂（sigma公司）皮内注射于小鼠右后足跖，监测小鼠足跖容积。24h之后，根据关节炎指数评分表，对模型小鼠足跖关节进行评定，若分数＞4分，则表示造模成功。

1.4 干预方法：分述如下。

1.4.1 温和灸组：选取小鼠脊柱L5、L6区域，备皮，暴露1cm×1cm皮肤，特制细艾条（5mm×200mm，南阳汉医有限公司）于选定区域悬灸20min，燃烧端距离皮肤12±2mm。同时，测温仪（HC-04型，杭州洪昌科技有限公司）监测小鼠施灸部位皮肤温度，保持在44±1℃。

1.4.2 辣椒平组：辣椒平溶于二甲基亚砜，生理盐水稀释配备为0.01%辣椒平溶液。从实验第2d起，小鼠腹腔注射辣椒平0.1ml/10g，每天1次，总共7d。

1.4.3 温和灸+辣椒平组：给予小鼠腹腔注射辣椒平（剂量同辣椒平组），15min后温和灸（方法同温和灸组）。干预时间：实验第2至第8d。

1.5 指标测量：分述如下。

1.5.1 足跖肿胀度：足跖容积测量仪（YLS-7B，济南益延科技发展有限公司）测量各组小鼠的右后足跖容积。测量时间：第1、2、4、6、8d。

1.5.2 血清指标：实验第8d，对实验小鼠行摘眼球取血。每只1.5ml，离心分离血清，收集0.5ml血清至1.5ml离心管，-20℃冰箱中保存。酶联免疫吸附法（Elisa）检测血清TNF-α，IL-1β；血清中硝酸还原酶法检测NO含量；比色法检测iNOS含量。所有检测由江苏省南京凯基生物有限公司完成。

1.6 统计学方法：采用SPSS21.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示。实验中各组数据先进行正态性和方差齐性检验，在满足正态分布和方差齐性的情况下采用单因素方差分析LSD法进行多重比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 辣椒平干预处理对温和灸及佐剂性关节炎模型小鼠的抗炎效应及其iNOS的影响：分述如下。

2.1.1 足跖肿胀度：如表1所示，实验第8d，模型组足趾肿胀度高于正常组（P＜0.01），表明造模成功；温和灸组、辣椒平组、温灸+辣椒平组足趾肿胀度均低于模型组（P＜0.01），表明三组干预均可改善CFA佐剂性关节炎模型小鼠的足趾肿胀度；温和灸组足趾肿胀度明显低于温和灸+辣椒平组（P＜0.05），表明辣椒平降低了温和灸对模型小鼠足趾肿胀度的影响。

表1 温和灸、辣椒平、温和灸+辣椒平对CFA佐剂性关节炎小鼠足跖肿胀度影响（±s，ml，n=10）

表1 温和灸、辣椒平、温和灸+辣椒平对CFA佐剂性关节炎小鼠足跖肿胀度影响（±s，ml，n=10）

注：与正常组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与温和灸组比较：#P＜0.05。

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2.1.2 炎症因子：如表2所示，实验第8d，模型组IL-1β、TNF-α、NO、iNOS明显高于正常组（P＜0.01）；温和灸组、辣椒平组、温和灸+辣椒平组IL-1β、TNF-α、NO、iNOS均明显低于模型组（P＜0.01）；辣椒平组、温和灸+辣椒平组IL-1β、TNF-α、NO、iNOS明显低于温和灸组（P＜0.01）。

表2 温和灸、辣椒平、温和灸+辣椒平对CFA佐剂性关节炎小鼠IL-1β、TNF-α、NO、iNOS的影响（±s，n=10）

表2 温和灸、辣椒平、温和灸+辣椒平对CFA佐剂性关节炎小鼠IL-1β、TNF-α、NO、iNOS的影响（±s，n=10）

注：与正常组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与温和灸组比较，#P＜0.05。

组别正常组模型组温和灸组辣椒平组温和灸+辣椒平组iNOS（U/ml）0.41±0.23 22.14±0.94▲▲6.33±0.72▲▲**9.18±1.28▲▲**##14.8 ±1.10▲▲**##IL-1β（pg/ml）31.39±1.86 83.45±8.61▲▲34.65±3.74▲▲**50.55±1.27▲▲**##71.02±1.85▲▲**##TNF-α（pg/ml）24.82±1.65 66.29±3.44▲▲31.00±1.22▲▲**37.18±1.08▲▲**##51.85±1.61▲▲**##NO(μmol/L)4.96±1.94 83.93±2.63▲▲30.87±1.12▲▲**36.38±2.21▲▲**##37.84±2.59▲▲**##

2.2 温和灸对TRPV1-/-佐剂性关节炎模型小鼠的抗炎效应及与iNOS的影响：分述如下。

2.2.1 足跖肿胀度：如表3所示，实验第8d，与野生模型组相比，野生温灸组足趾肿胀度有明显下降（P＜0.01）；与TRPV1-/-模型组相比，TRPV1-/-温和灸组足趾肿胀度没有明显变化（P＞0.05）。

表3 温和灸对TRPV1-/-、野生型CFA佐剂性关节炎小鼠足跖肿胀度的影响（±s，ml，n=8）

表3 温和灸对TRPV1-/-、野生型CFA佐剂性关节炎小鼠足跖肿胀度的影响（±s，ml，n=8）

注：与野生模型组比较：**P＜0.01。

组别野生模型组野生温和灸组TRPV1-/-模型组TRPV1-/-温和灸组Day 8 0.302±0.016 0.259±0.017**0.292±0.003 0.280±0.010 Day 1 0.171±0.012 0.177±0.010 0.153±0.011 0.159±0.008 Day 2 0.256±0.014 0.250±0.019 0.283±0.016 0.287±0.033 Day 4 0.262±0.018 0.253±0.019 0.280±0.015 0.288±0.018 Day 6 0.311±0.029 0.286±0.014 0.290±0.025 0.286±0.012

2.2.2 炎症因子：如表4所示，实验第8d，与野生模型组相比，野生温和灸组血清IL-1β、TNF-α、NO含量、iNOS活性有明显下降（P＜0.01）；与TRPV1-/-模型组相比，TRPV1-/-温和灸组 IL-1β、TNF-α 无明显变化（P＞0.05）。TRPV1-/-温和灸组小鼠经过7d温和灸后血清中NO含量、iNOS活性与TRPV1-/-模型组小鼠相当（P＞0.05）。

表4 温和灸对TRPV1-/-、野生型CFA佐剂性关节炎小鼠IL-1β、TNF-α、血清NO含量、iNOS活性的影响（±s，n=8）

表4 温和灸对TRPV1-/-、野生型CFA佐剂性关节炎小鼠IL-1β、TNF-α、血清NO含量、iNOS活性的影响（±s，n=8）

注：与野生模型组比较，**P＜0.01。

组别野生模型组野生温和灸组TRPV1-/-模型组TRPV1-/-温和灸组IL-1β（pg/ml）82.93±3.39 65.99±5.45**79.98±1.67 75.44±2.05 TNF-α（pg/ml）58.63±1.96 38.06±1.52**44.98±1.95 44.39±2.01 NO(μmol/L)49.45±2.91 26.36±0.89**67.10±1.52 64.57±2.09 iNOS（U/ml）17.50±0.73 8.78±1.06**12.41±0.31 11.61±0.49

3 讨论

TRPV1是温和灸抗炎的分子效应途径。通过观察温和灸对炎症模型的影响，我们验证了温和灸的抗炎效应由TRPV1介导，TRPV1是温和灸的主要效应途径[4]。

TRPV1介导iNOS表达下调是艾灸抗炎效应途径之一。外周血细胞均表达TRPV1[9]，而NO是炎症反应的关键介质。iNOS在单位时间内释放的NO量比结构型NOS（内皮源性eNOS、神经元性nNOS）大1000倍[10]。TRPV1在炎症的加剧与发展相关，NO水平降低是相关表现之一[11]。iNOS抑制剂在感染性休克实验中显示了疗效[12]，目前临床缺少有效以iNOS为靶向治疗的特异性药物治疗方法。因此，本研究的结果为临床运用灸法抑制炎症反应提供了理论依据。

温和灸下调iNOS、降低NO量为艾灸治疗临床危重急症提供支撑。文献记载神阙灸是古代危重急症的常见急救措施[13]。iNOS源性NO是炎症反应中炎症递质瀑布样连锁反应的最终共同递质之一，也是导致感染性休克的关键递质[14]，是感染性休克血压降低、微循环障碍的关键分子[15]。iNOS源的NO释放量增加是感染性休克、全身炎症反应综合征（SIRS）的主要病理环节。在本研究结论的基础上，临床结合腧穴的部位特异性（如神阙）可以进一步放大抑制iNOS、降低NO量的治疗靶向性，提高临床治疗效力；同时避免iNOS抑制剂的副反应[16]。

展望：在明确了TRPV1介导温和灸抗炎、降低iNOS表达的机制基础上，进一步研究温和灸抗应激的iNOS机制以及针对不同病理靶向的有效应用于临床的温和灸操作方法具有可行性。