楼毅云 吴晓婷 傅 萍

浙江省杭州市中医院 浙江 杭州 310007

复发性流产发病机制复杂，是生殖医学领域中亟待解决的问题之一。本研究从复发性流产肾虚证入手，发现肾虚型复发性流产者子宫蜕膜中PI3K信号通路的相关分子血清和糖皮质激素激酶（SGK1）以及透明质酸合成酶（HAS1、HAS2、HAS3）、透明质酸酶（Hyal-2）透明质酸合成酶的mRNA表达量显著降低，提示复发性肾虚自然流产与子宫蜕膜中PI3K信号通路的下调相关，应用益肾安胎中药提高蜕膜细胞中PI3K、SGK1HAS1、HAS3、Hyal-2的表达。现将研究结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：经杭州市中医院伦理委员会批准，以2012年6月～2016年12月期间妊娠早期（妊娠12周之前），并且依从性强，愿意配合随访的妊娠患者为研究对象，均符合相关中西医诊断和纳入标准[1-2]。选取复发性流产肾虚证者30例为实验组，年龄20～39岁，平均28.62±2.69岁，自然流产次数2～4次，平均2.17±0.45次，孕周7～11周，平均8.80±2.97周。正常早期妊娠的孕妇要求人工流产者30例作为对照组，年龄22～34岁，平均27.00±5.08岁，自然流产次数0～3次，平均1.58±0.21次，孕周5～10周，平均7.41±2.44周。两组患者年龄及孕周比较，无统计学差异（P＞0.05）。

1.2 样本收集及处理：按照材料所述纳入和排除标准进行实验组和对照组标本采集和分析，进行分组。预先准备好装有生理盐水的50ml离心管，将清宫术后的蜕膜组织放入生理盐水中，冰盒内术后30分钟运输至实验室。生理盐水冲洗蜕膜组织，吸水纸吸净组织表面生理盐水。冻存管分装后放在液氮中冻存30～60min。取出，放入-80℃冰箱长期保存。

1.3 药物制备：精密称取菟丝子、覆盆子、桑寄生、苎麻根各200g，阿胶、当归、杭白芍粉各150g，碎成粗粉，混合，进行回流提取，提取后旋转蒸发浓缩，滤过，滤液减压回收定容至250ml，分装灭菌，备用。每剂处方所含成分以金丝桃苷和槲皮素作为质控标准（经LC-MS测定）。取1ml滑胎安胎协定方混合提取物（2g/ml），加入完全培养液，配制成浓度为30mg/ml母液，EP管分装，每支10ml，-20℃冻存备用，使用前稀释至终浓度。

1.4 原代人蜕膜细胞培养：无菌条件下获得正常早期妊娠清宫术中蜕膜组织，置于含有1%双抗的培养基中，在无菌条件下，用已消毒的眼科剪将蜕膜组织剪碎成糊状，消化，过滤，置于1000rpm，离心，裂解，置于5%CO2培养箱内培养。以上中药处理蜕膜细胞培养过夜，另设空白对照组。

1.5 检测内容及方法：分述如下。

1.5.1 免疫组化检测：实验组和对照组新鲜蜕膜组织用中性缓冲福尔马林固定12～24小时后，梯度酒精脱水，石蜡包埋并切片。高温高压抗原修复后滴加PI3K一抗，37℃下孵育，PBS冲洗，滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，冲洗后显色。Harris苏木素液复染细胞核，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5.2 RT-PCR检测母胎界面PI3K通路相关基因的表达水平：实验组和对照组蜕膜组织基因组抽提后进行总RNA浓度测定，PCR扩增后，采用应用逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）测定蜕膜细胞中PI3K通路相关基因的表达水平；原代人蜕膜细胞培养后，测定蜕膜组织中表达有差异的基因在蜕膜细胞空白组和中药组的表达水平。

1.6 统计学分析：应用spss16.0统计软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，进行方差分析或t检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 PI3K在蜕膜组织中的表达：本研究对实验组和对照组子宫蜕膜组织进行免疫组织化学实验，结果显示PI3K在早期妊娠蜕膜组织中有表达，H-score评分半定量分析（图1）显示实验组蜕膜组织中PI3K的表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 H-score评分半定量分析早期妊娠蜕膜组织中PI3K的表达

图2 两组蜕膜组织中相关基因mRNA水平

2.2 PI3K信号通路上相关基因子宫蜕膜组织mRNA相对表达：实验组和对照组子宫蜕膜组织，以GAPDH为内参，对PI3K、SGK1、HAS1、HAS2、HAS3、Hyal-1、Hyal-2及Hyal-3的表达进行Real time PCR分析，PI3K在实验组中的相对表达量显著低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01)；PI3K信号通路上相关分子SGK1、HAS1和HAS3在实验组中的相对表达量显著低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01)；HAS2在实验组中的相对表达量低于正常妊娠组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Hyal-1与GAPDH相比在实验组和对照组中表达量无显著性差异（P＞0.05）；Hyal-2在实验组中的相对表达量显著低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01)；Hyal-3与GAPDH相比在实验组和对照组中表达量无显著差异（P＞0.05)。见图2。

2.3 益肾安胎中药对蜕膜细胞PI3K信号通路上相关基因mRNA相对表达的影响：益肾安胎中药处理人蜕膜细胞，对中药组和空白组蜕膜细胞中PI3K、SGK1、HAS1、HAS2、HAS3、Hyal-2的表达进行Real time PCR分析，PI3K在中药组中的相对表达量明显高于空白组，差异具有统计学意义（P＜0.01)，SGK1、HAS1和Hyal-2在中药组中的相对表达量高于空白组，差异具有统计学意义（P＜0.05)；HAS3在中药组中的相对表达量低于空白组，差异具有统计学意义（P＜0.01)；HAS2在两组中表达量无显著差异（P＞0.05)。见图3。

图3 益肾安胎中药对蜕膜细胞PI3K信号通路上相关基因mRNA相对表达的影响

3 讨论

早期妊娠丢失，是孕期常见现象，据统计临床妊娠中仅30%～50%的妊娠能维持至妊娠20周以上，其中约75%的妊娠丢失发生在妊娠早期，即妊娠12周前的早期流产[3]。自然流产连续发生2次及以上则为复发性流产，本病不仅给患者带来生理痛苦，可造成夫妇心理负担[4]，甚则会影响到家庭关系的稳定，是生殖医学领域中亟待解决的问题之一。历代医家多认为本病为肾虚、脾虚、血热、气血虚弱、血瘀等所致。但肾为先天之本，主生殖，主藏精而系胞胎。妇人受妊，本于肾气之旺。胎者也，本精与血之相结而成，胎孕既成，则有赖先天精气之滋养及肾气之巩固。肾气旺盛，脏腑协调，胞宫安和，胎者泰然蓬生，自无堕胎之虞，若肾气匮乏，封藏失职，冲任不固，胞胎难系，即成堕胎之疾[5]。故病因虽多，众医家仍以肾为关键。因此，中医治疗以补肾固冲为安胎预防复发性流产的基本之法，临证多遣用菟丝子、桑寄生、阿胶等益肾安胎、养血敛精之品[6]。临床上常适加益气健脾之品，使先后天同补，气血得生，胎元得固，而达到保胎养胎之目的。即使是其他因素所致胎元不固而发生的流产，亦常以补肾为大法加减化裁而取得良效。临床报道，中药补肾之法提高先兆流产患者血清人绒毛膜促性腺激素、孕激素、雌二醇的水平，缓解先兆流产的临床症状，阻止其进一步向自然流产的发展，从而提高先兆流产的治愈率[7]。

PI3K是哺乳动物细胞内基础信号转导途径中的主要细胞因子之一，在细胞的生长、增殖、代谢、迁移、分化、凋亡、血管生成、自吞噬等多种生理功能和病理过程中发挥着极其重要的生物学功能，PI3K及其相关转导因子紊乱在神经系统病变、自身免疫性疾病、造血系统疾病和恶性肿瘤等多种病变均有报道[8]。基因修饰的小鼠模型研究表明，PI3K及其相关转导因子在卵细胞发育与激活、卵泡发育与排卵、卵细胞减数分裂的重启与胚胎早期的发育、小鼠卵巢肿瘤以及乳腺肿瘤的发生和发展中起重要作用[9]。研究表明PI3K相关转导因子中的上游分子PI3K家族中class I催化亚基的p110 delta亚型（Pik3cd基因编码）在介导外源性激素如雌激素（estrogen）和卵泡刺激素（FSH）影响下的卵巢颗粒细胞分泌及卵泡生长中起重要的作用，其缺失后会影响颗粒细胞的生长和增殖，进而影响后续早期妊娠胚胎的发育与生存[10]。

本研究结果发现正常妊娠对照组子宫蜕膜高表达PI3K，肾虚型复发性流产患者子宫蜕膜中PI3K以及PI3K信号通路上相关分子SGK1以及HAS1、HAS2、HAS3、Hyal-2的表达明显下降。应用益肾安胎中药（菟丝子、覆盆子、桑寄生、苎麻根、阿胶、当归、杭白芍）处理人蜕膜细胞，PI3K、SGK1、HAS1、HAS3和Hyal-2的相对表达量增加。本研究得出结论肾虚型复发性流产者子宫蜕膜中PI3K信号通路上相关分子PI3K以及SGK1、HAS1、HAS2、HAS3、Hyal-2的mRNA表达量显著降低，并且HAS1、HAS2、HAS3的蛋白表达较正常妊娠组减少，肾虚自然流产与子宫蜕膜中PI3K信号通路的下调相关。益肾安胎中药提高蜕膜细胞中PI3K、SGK1、HAS1、HAS3和Hyal-2的表达，益肾安胎中药可通过调节PI3K信号通路从而改善妊娠结局。

本研究通过研究肾虚型复发性流产和正常妊娠孕妇母胎界面PI3K信号通路上相关分子的表达，分析母胎界面PI3K及其信号通路上相关分子的表达与肾虚型复发性流产的联系；通过研究益肾安胎中药对蜕膜细胞PI3K及其信号通路上相关分子表达改变的影响，进一步阐述母胎界面PI3K及其信号通路上相关分子的表达影响妊娠结局的机理，为中医药补肾治疗提供实验依据，进一步为复发性流产发病机制及中医药防治的研究提供新的思路和途径。