刘荣华 ，何文容

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育龄期妇女中最常见的内分泌疾病，主要临床特征是月经不调、雄激素过多症、不孕症和代谢异常的无排卵［1-2］。研究表明，PCOS的发病与遗传、环境和饮食生活习惯等有关，且多种基因参与了疾病的发生、发展［3］，但目前尚无特效治疗方法。Patel等［4］于2008年从健康女性经血中分离出一种间充质干细胞，将其命名为经血源干细胞（Men-strual derived stem cells，MenSCs），其具有多向分化潜能及细胞因子分泌功能，能够有效修复受损组织，促进组织再生。随着干细胞研究及应用的迅速发展，干细胞移植被用于心肌梗死［5］、帕金森病［6］、脑缺血性损伤［7］等疾病治疗也已取得初步疗效，这也为PCOS的治疗提供了新的思路。目前，有关PCOS的干细胞治疗研究较少，既有文献多为脂肪干细胞治疗，但效果有限［8］。因此，本实验通过构建PCOS动物模型，探讨MenSCs移植对大鼠PCOS的影响及潜在的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 8周龄雌性健康成年SD大鼠45只，体质量180～210 g，购自湖北省实验动物中心，动物饲料购自上海普路腾生物科技有限公司。脱氢表雄酮（DHEA）购自上海麦克林生化科技有限公司。胎牛血清和DMEM培养基购自美国HyClone公司。miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒和miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒（SYBR Green）均购自天根生化科技（北京）有限公司。BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所。Bax多克隆抗体购自美国Sigma公司。酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自美国R&D公司。形态学观察采用Olympus BX51显微镜。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理 MenSCs细胞株由亚洲干细胞库赠与，细胞置于37℃、浓度5%CO2培养箱中培养，培养基为含有10%胎牛血清的DMEM，细胞融合至80%左右传代，制备细胞悬液。

1.2.2 动物模型 所有大鼠均自由饮食，饲养环境温度（25±2）℃，湿度（60±5）%，光照时间8 h，5只一笼，笼底垫辐照垫料。适应性喂养1周后随机分为3组：对照组15只，不做干预处理，饲养5周；PCOS组15只，肌内注射DHEA，注射剂量为60 mg/kg，连续注射20 d，饲养5周［9］。移植组15只，肌内注射DHEA，注射剂量为60 mg/kg，连续注射20 d，饲养3周后，经尾静脉注射MenSCs悬液200 µL（5.0×107个/mL），注射后再继续饲养2周［10］。

1.2.3 血清学检查 3组大鼠于第5周末通过眼眶静脉丛取血，每只大鼠收集约0.5 mL，ELISA试剂盒检测促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinising hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）、孕激素（progesterone，P）、睾酮（testosterone，T）、泌乳素（prolactinemia，PRL）。

1.2.4 卵巢形态学观察 各组大鼠于第5周末全部处死后取出卵巢组织，用预冷的生理盐水洗涤。组织在10%福尔马林中固定24 h，梯度乙醇脱水并包埋在石蜡中。将组织切成6个固定切片（5µm），用苏木精和伊红染色。通过显微镜（×200）观察卵巢形态学改变并拍照。

1.2.5 实时荧光定量PCR（qPCR）检测miRNA-135表达 用Trizol裂解细胞提取卵巢组织总RNA后逆转录为cDNA。qPCR反应体系为20µL，根据试剂盒说明书将miRcute Plus miRNA PreMix（10 µL）、ROX Reference Dye（1.6 µL）、上下游引物各0.4µL，cDNA和ddH2O加入体系反应。miRNA-135引物序列：上游5′-UAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUG-3′，下游 5′-AACAUAGGAAUAAAAAGCCAUAUU-3′；内参为 U6，上 游 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qPCR反应条件：预变性95℃3 min；变性95 ℃ 10 s、退火60 ℃ 10 s、延伸70 ℃ 10 s，扩增40个循环；65～95℃，每0.5℃5 s梯度递增；终止反应。实时荧光定量系统为Applied Biosystems®7300，数据采用Step One 2.3分析。

1.2.6 蛋白表达检测 用RIPA裂解液提取卵巢组织中的总蛋白。BCA试剂盒定量检测蛋白质浓度。5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，电转移到聚偏二氟乙烯膜上；将膜与Bax多克隆兔抗体（1∶800稀释），4℃温育12 h，与辣根过氧化物酶缀合的二抗室温孵育1 h（1∶6 000）。电化学发光试剂盒检测信号，凝胶成像仪采集图像，使用Quantity One 4.6分析软件定量蛋白质条带强度。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量数据用均数±标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用Bonferroni-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清学检查结果比较 3组大鼠E2、P及PRL差异无统计学意义。与对照组比较，PCOS组FSH水平降低，而LH和T水平升高（P＜0.05），其他指标差异无统计学意义；移植组与对照组各指标差异均无统计学意义。与PCOS组比较，移植组FSH水平升高，而LH和T水平降低（P＜0.05），其他指标差异均无统计学意义，见表1。

2.2 卵巢形态观察 对照组卵泡形态正常，PCOS组卵巢可见到较多囊状扩张的卵泡，移植组多囊状扩张的卵泡较PCOS组减少，见图1。

2.3 各组卵巢组织中miRNA-135、Bax和Bcl-2的表达水平比较 与对照组比较，PCOS组miRNA-135和Bcl-2蛋白相对表达水平降低，而Bax蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）；与PCOS组比较，移植组miRNA-135和Bcl-2蛋白相对表达水平升高，Bax蛋白表达水平降低（P＜0.05），见表2、图2。

Tab.1 Comparison of the metabolic and hormonal indicators between three groups表1 3组大鼠代谢和激素指标比较 （n=15，±s）

Tab.1 Comparison of the metabolic and hormonal indicators between three groups表1 3组大鼠代谢和激素指标比较 （n=15，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与对照组相比，b与PCOS组相比，P＜0.05

组别对照组PCOS组移植组F FSH（mU/ml）15.25±4.56 8.54±5.50a 12.67±4.32b 7.396＊＊LH（nmol/L）10.65±2.66 19.28±3.85a 15.42±3.21b 26.120＊＊E2（nmol/L）0.24±0.06 0.22±0.05 0.20±0.04 2.338 P（nmol/L）25.65±6.58 23.55±8.23 26.68±9.10 0.591 T（nmol/L）1.25±0.22 1.64±0.48a 1.45±0.32b 4.490＊PRL（nmol/L）0.48±0.12 0.51±0.18 0.46±0.17 0.377

Fig.1 Comparison of the ovarian morphological changes between three groups（HE staining,×200）图1 各组大鼠卵巢形态变化对比（HE染色，×200）

Tab.2 Comparison of the expressions of miRNA-135,Bax and Bcl-2 proteins between three groups表2 各组卵巢组织miRNA-135、Bax蛋白及Bcl-2蛋白的相对表达水平比较 （n=15，±s）

Tab.2 Comparison of the expressions of miRNA-135,Bax and Bcl-2 proteins between three groups表2 各组卵巢组织miRNA-135、Bax蛋白及Bcl-2蛋白的相对表达水平比较 （n=15，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与对照组相比，b与PCOS组相比，P＜0.05

组别对照组PCOS组移植组F miRNA-135 1.03±0.03 0.43±0.16a 0.77±0.12b 99.610＊＊Bax蛋白1.05±0.04 1.87±0.39a 1.65±0.56b 17.430＊＊Bcl-2蛋白1.02±0.03 0.77±0.29a 0.85±0.26b 4.807＊

Fig.2 The protein expressions of Bax and Bcl-2 in ovarian in three groups图2 3组大鼠卵巢组织中Bax和Bcl-2的表达

3 讨论

PCOS是一种多因素共同作用、多基因参与的疾病。目前，PCOS常用的治疗药物有氯米芬、绒促性素、糖皮质激素和尿促性素等，手术治疗为双侧卵巢楔形切除术，药物和手术治疗均有一定的风险［11］。随着干细胞研究的不断深入，用干细胞来治疗许多难以治愈的疾病已成为可能。目前，有关PCOS的干细胞治疗研究较少，有报道脂肪干细胞治疗对于PCOS有治疗效果，但存在一定局限［8］。近年来，通过刮宫、手术等方式获取子宫内膜干细胞的创伤性方法已经逐步被无创性方法取代，女性经血也可以获取子宫内膜干细胞。MenSCs与其他类型的间充质干细胞相比，具有取材无创伤性、细胞增殖速度快和低免疫原性等优点，这使异体移植成为可能。本研究发现，经过MenSCs注射以后，移植组FSH、LH、T水平较PCOS组均有明显的改善，且移植组多囊状扩张的卵泡较PCOS组减少，表明干细胞移植对于PCOS有较明显的治疗效果。

干细胞移植到体内以后，通过“归巢”（Homing）方式对损伤组织进行修复［12］。干细胞归巢是细胞迁移到并植入其可以发挥局部功能效应的组织的过程。干细胞具有优先“归巢”到损伤与炎症部位的特点，并可促进组织结构和功能的恢复［12］。研究表明，归巢是由流动细胞和靶组织处的血管内皮之间的抗剪切黏合剂相互作用引发的级联事件。该过程由“归巢受体”介导，“归巢受体”与相关的内皮共受体结合，可导致内皮表面上的细胞束缚和滚动接触，随后是趋化因子触发的整联蛋白黏附性和外渗的活化［13］。另有研究认为，无论组织如何，干细胞都可选择性地归巢于损伤部位［14］。

研究显示，在PCOS患者的卵泡液及颗粒细胞中miRNA-135表达量较正常人明显增加，而miRNA-135具有抑制凋亡基因Bax表达的功能［15］。本研究结果显示，PCOS组较对照组miRNA-135的表达降低，而移植组较PCOS组的表达升高，表明MenSCs注射抑制了miRNA-135降低。Bax基因是Bcl-2基因家族的一员。Bax基因编码Bax蛋白，Bax蛋白通过激活线粒体电压依赖阴离子通道（voltagedependent anion channel，VDAC）并与之相互作用，可导致细胞膜电位下降并释放细胞色素C。Bax蛋白还可与Bcl-2家族其他蛋白形成二聚体，促进细胞凋亡。相关研究表明，Bax和Bcl-2信号传导途径与PCOS大鼠颗粒细胞的凋亡密切相关［16］。在这些靶标中，Bcl家族成员被认为是细胞凋亡的主要调节因子，最具特色的成员是Bcl-2和Bax。Bax蛋白作为Bcl-2的拮抗剂，是Bcl-2的相关蛋白同源物。通过Bax蛋白促进细胞凋亡的途径可能与抗凋亡蛋白Bcl-2有关［16-17］。相关研究表明，Bax在组织和器官中的表达比Bcl-2更广泛，并且它也在雄性睾丸和雌性卵巢中表达［17］。本研究结果显示，PCOS组较对照组卵巢组织Bax蛋白过量表达，Bcl-2蛋白表达降低；而移植组较PCOS组Bax蛋白过量降低，Bcl-2蛋白表达过量，表明干细胞移植降低了Bax的表达，升高了Bcl-2表达，提示Bax和Bcl-2途径可能在干细胞修复PCOS损伤中起了重要作用。

综上所述，MenSCs是一种在临床治疗和修复上有意义的效应细胞，有望被广泛地应用于治疗领域。