王敏敏，魏建宏，任来峰

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的重要风险因素［1］，而HCC是最为难治的恶性肿瘤之一，也是我国位居第二的癌症“杀手”，HCV感染约与20%的HCC相关［2］。HCV核心蛋白（Core蛋白）除了参与病毒组装外，还能与正常细胞蛋白相互作用，扰乱细胞正常的信号转导、转录调控等信号传递［3］。HCV Core蛋白被认为是HCV相关HCC的潜在癌基因或辅因子［4-5］，有研究表明，过表达HCV Core后，在其转基因（TG）小鼠中可以诱导肝癌的形成［6］。

自噬是一种利用溶酶体将自身细胞内受损、变性或衰老的蛋白以及细胞器消化降解的过程，并参与细胞多种生理及病理过程调控［7］，细胞自噬与肿瘤的发生发展密切相关。有研究表明，HCV Core蛋白可诱导肝细胞自噬［8-9］］，而 Hara等［10］研究显示，HCV Core蛋白可抑制HCV感染时的有丝分裂；有研究认为，这种抑制可导致线粒体泛素化、有丝分裂体形成和自噬降解的失败［11］。有关HCV Core蛋白与自噬的关系研究尚不多，其具体机制仍有待阐明。因此，本研究拟通过在HeLa细胞中表达外源HCV Core蛋白，研究其对HeLa细胞自噬的影响，为进一步阐明HCV相关的HCC的发病机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 主要材料 PLVX-IRES-ZsGreen1过表达质粒和HCV复制子质粒（pJFH1）为本实验室保存，大肠埃希菌感受态细胞DH5α购自索莱宝生物技术公司，人宫颈癌HeLa细胞株购自丰晖生物技术公司，In-Fusion®HD Cloning Kit购自Clontech公司，凝胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒均购自Omega公司。限制性内切酶XhoⅠ购自北京百奥莱博科技有限公司，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成引物合成及DNA测序；DNA转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，核染料DAPI购自Vector公司，抗HCV Core抗体购自博奥森公司，实验所用FITC标记的二抗（抗鼠）和内参α-tubµlin抗体以及Cyc3标记的二抗（抗兔）均购自Sigma公司，抗LC3B抗体购自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 载体的构建 （1）目的基因扩增：按照同源重组原理设计Core基因引物，上游5′-CGGTGAATTCCTCGAATGAGCACAAATCCTAAACC-3′，下游 5′-TAGAACTAGTCTCGATCAAGCAGAGACCGGAACGGT-3′。以 pJFH1为模板进行PCR扩增，反应体系为：上、下游引物各1µL，pJFH1模板0.5µL，Taq DNA聚合酶0.5µL，dNTP混合液0.5µL，PCR Buffer 2.5µL，ddH2O 19µL。反应条件：95℃预变性3 min；95℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 150 s，共34个循环；72 ℃ 5 min充分延伸。PCR产物分离并纯化，4℃保存备用。（2）重组载体克隆：XhoⅠ限制性内切酶切割空载体PLVX-IRES-ZsGreen1使之线性化，并用凝胶回收试剂盒回收纯化；用IN-fusion cloning kit将

HCV Core基因片段与线性化载体进行重组；将重组质粒转化到含氨苄青霉素（Amp）LB培养平板，于37℃培养12 h；挑取LB转化板上的阳性菌落，接种于15 mL（含Amp）LB液体培养基中，置于37℃摇床培养18 h（180 r/min）。次日按说明书提取质粒，选用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定重组质粒PLVXIRES-ZsGreen1-Core，并送博奥公司测序证实。

1.2.2 细胞的传代与培养 用DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清和1%双抗）在37℃、5%CO2孵箱中培养宫颈癌HeLa细胞，每隔1～2 d更换新鲜培养基，待细胞长至汇合度达85%～90%时，用胰酶消化进行传代培养。

1.2.3 质粒转染 选取对数生长期的HeLa细胞接种于无菌24孔细胞培养板中，常规培养待细胞贴壁生长至约50%～60%汇合度时进行细胞转染，设PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组、PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组以及未转染质粒的空白对照组，采用Lipofectamine 2000按试剂说明书进行操作。转染完成6～8 h后换常规DMEM高糖培养基并于48～72 h后进行后续实验。

1.2.4 免疫印迹（Western Blot）检测Core蛋白以及LC3蛋白的表达 参照文献［12］：转染48 h后，弃去24孔板中的培养基并用预冷的PBS清洗1次，经RIPA裂解液裂解后收集各组细胞并抽提细胞总蛋白，经BCA蛋白定量试剂盒定量并调整蛋白浓度，按说明书加入5×loading buffer煮沸后得到蛋白样品。总蛋白经12%SDS-PAGE电泳分离后转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h（摇床），分别用抗HCV Core（1∶100）、LC3B（1∶1 000）、α-tubµlin（1∶5 000）抗体4 ℃孵育过夜，TBST漂洗；再用HRP标记的抗兔和抗鼠二抗（1∶2 000）37℃孵育1 h，TBST漂洗，将膜用ECL显色，Fluor Chem FC2成像仪曝光并分析结果，实验重复3次。

1.2.5 免疫荧光（IF）检测LC3水平 参照文献［13］：HeLa细胞接种到24孔板中的细胞爬片上并转染相应质粒48 h后直接收样；PBS洗涤1次，4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS漂洗后；用0.3%Triton X-100室温通透10 min，PBS漂洗；用免疫荧光封闭液（0.1%Triton X-100+1%BSA）室温封闭30 min以上，加入抗LC3B或抗Core抗体37℃湿盒中孵育30 min，用PBS洗3次；37℃湿盒中孵育荧光素标记的抗兔或抗鼠二抗30 min，PBS洗3次；DAPI封片，荧光显微镜拍片记录结果，实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示，2组间均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒的构建及鉴定 重组载体用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切结果显示，酶切后的重组质粒为2个条带，大小分别与空载体PLVX-IRES-ZsGreen1和目的基因Core近似，见图1A。测序结果示，与标准序列比对，重组质粒PLVX-IRES-ZsGreen1-Core序列完全正确，见图1B。

Fig.1 Core-Green digested with EcoRⅠand BamHⅠ图1 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒的鉴定

2.2 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒在HeLa细胞中的表达 只有PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组的细胞可表达HCV Core蛋白，而PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染组和未转染质粒空白对照组的无蛋白表达，且与Core蛋白的相对分子质量符合，见图2。

Fig.2 Expression of HCV Core protein in HeLa cells图2 HCV Core蛋白在Hela细胞中的表达

2.3 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒诱导HeLa细胞自噬 LVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组的细胞LC3Ⅱ水平（1.069±0.049）高于PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组（0.776±0.047），差异有统计学意义（t=7.433，P＜0.05），见图3。免疫荧光染色结果显示，与Western Blot结果一致，HCV Core蛋白高表达的细胞（绿色荧光）LC3焦点明显增多，且主要分布于细胞质中，见图4。

Fig.3 Expression of LC3 detected by Western Blot assay图3 Western Blot法检测LC3蛋白表达

3 讨论

基因克隆是分子生物学的基本技术，与传统的基于双酶切的分子克隆技术比较，近年来发展起来的基于同源重组的分子克隆技术（又称为无缝克隆），具有简便、快速、高效和适用范围广等优点［14］。本实验运用同源重组克隆方法构建了PLVX-IRESZsGreen1-Core真核表达载体，并经双酶切和基因测序证实，重组DNA序列正确，重组质粒转染人宫颈癌HeLa细胞后可表达HCV Core蛋白，这些结果证实已成功构建了HCV Core真核表达载体。

Fig.4 The changes of LC3 punctuates induced by HCV Core（×1 000）图4 HCV Core蛋白诱导的LC3焦点变化（×1 000）

研究表明，HCV Core蛋白是诱导肝癌发生的最重要蛋白之一［15］，可通过干扰宿主细胞多条信号通路诱导细胞转化［16］，但其具体致癌细节仍需进一步研究。自噬是细胞适应环境变化的一种生理病理过程，以细胞质内出现自噬体为特征，也是吞噬降解细胞内部分受损细胞器或变性蛋白的过程［17］。在自噬发生时，微管相关蛋白1轻链3（microtubuleassociated protein1 light chain3，LC3）定位于前自噬体和自噬体表面，参与自噬体的整个形成过程，LC3有Ⅰ型和Ⅱ型，自噬发生时伴随着LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化，因此，该转化过程成为评价细胞自噬的重要参考［18-19］。自噬与肿瘤的发生发展密切相关，Liu等［20］研究表明，HCV Core蛋白可诱导肝QSG-7701细胞自噬，并伴随着LC3Ⅱ升高；Wang等［21］在肝癌细胞Huh7中的研究表明，HCV Core蛋白通过EIF2AK3和ATF6促进细胞自噬；而Hara等［10］研究则显示，HCV Core蛋白可抑制细胞线粒体自噬。本研究中，Western Blot结果显示，PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组自噬标记分子LC3Ⅱ表达增加，免疫荧光结果显示LC3Ⅱ荧光焦点增多，证实HCV Core蛋白可提高HeLa细胞自噬水平。另有研究表明，HCV诱导细胞自噬对病毒自身的复制至关重要［22］，同时细胞自噬信号的扰乱势必干扰细胞正常生理过程，可能是其引起细胞恶性转化的促进因素，但具体细节仍待进一步研究。

综上所述，本研究用无缝克隆方法构建PLVXIRES-ZsGreen1-Core重组质粒，并可在转染的HeLa细胞中诱导细胞自噬，为进一步探索HCV Core蛋白干扰宿主细胞功能奠定了一定的基础。