袁乐永，王梅芳

紧密连接蛋白是存在于上皮细胞与内皮细胞之间的一种蛋白质，其作用是保持细胞间结构的完整性。OCCLUDIN蛋白作为紧密连接蛋白的一种主要类型，其结构或表达水平发生变化会导致紧密连接结构及功能的改变，最终引起一些临床疾病的发生。研究发现OCCLUDIN在多种肿瘤组织中表达异常，且OCCLUDIN与肿瘤细胞增殖和凋亡等有密切关系［1-4］。目前关于OCCLUDIN对非小细胞肺癌发生发展的影响及其作用机制尚不清楚。本研究主要通过荧光定量PCR、Western blot、CCK-8法和流式细胞术等方法，在体外探讨OCCLUDIN对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 非小细胞肺癌细胞系SPC-A1细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。OCCLUDIN siRNA、NC siRNA和Lipofectamin 2000™购自Thermo Fisher Scientific公司；RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清购自Hyclone公司；二甲基亚砜、DMEM培养基、青霉素和链霉素均购自Gibco公司；胰蛋白酶和PBS购自碧云天公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、RIPA总蛋白裂解液、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、ASPEN ECL化学发光和显影定影液均购自ASPEN公司；Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、AIF、Cyt C、AKT、PI3K和内参GAPDH一抗均为兔抗人多克隆抗体，二抗为羊抗兔，所有抗体均购自Abcam公司；Annexin VAPC细胞凋亡试剂盒购自碧云天生物公司；荧光定量PCR仪购自德国罗氏公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组 将0.5×105个SPC-A1细胞接种至500µL含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞生长至70%～80%以上。实验分组：将细胞分为空白对照组、阴性对照转染组（siCtrl组）和OCCLUDIN siRNA转染组（siOCLN组）。具体Lipofectamin 2000™转染siRNA配制方案见表1，siRNA终浓度为50 nmol/L；本研究设计2条OCLN siRNA序列，分别为5′-GGCCTCTTGAAAGTCCACCTCCTTA-3′ 和 5′-CCAAGAGCAGCAAAGGGCTTCATG-3′，同时本研究选择1条 Ctrl siRNA 5′-CCUUUUAGGAGGUAGUGUAtt-3′，所有siRNA序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。转染后将培养板置于培养箱中于37℃、5%CO2条件下培养约24～48 h。

1.2.2 荧光定量PCR检测OCCLUDIN mRNA表达水平 将SPC-A1细胞以1.0×105/mL的密度接种于96孔板，按照表1方案进行siRNA转染，OCCLUDIN两条siRNA混合一起进行转染，转染后将培养板在培养箱分别孵育24 h，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，将RNA逆转录成cDNA并进行荧光定量PCR检测，实验重复3次，数据采用2-ΔΔCt法进行分析。本研究使用的OCCLUDIN引物序列为，上游5′-CTCCCTGGCACCGTTGG-3′，下游5′-GGCCAACATGAAGCCCTTTG-3′。

1.2.3 Western blot检测相关蛋白表达 收集各组SPC-A1细胞，加入细胞裂解液后提取蛋白，并用BCA法测定蛋白质浓度，取60µg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳结束后转膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，室温封闭1 h，加入一抗，同时以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，1∶5 000稀释）为内参，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次10 min。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min。洗膜结束后用凝胶成像系统进行显影。

Tab.1 SiRNA preparation program for lipofectamin 2000TMtransfection表1 Lipofectamin 2000™转染siRNA配制方案

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖 各组SPC-A1细胞以1.0×105/mL的密度接种于96孔板，将培养板在培养箱分别孵育24、48、72、96、120 h，并在每个时间点加入10 µL CCK-8溶液（Dojindo）；将培养板置于培养箱中，1 h后于450 nm波长下采用酶标仪测定每孔光密度（OD）。每组重复3次。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组SPC-A1细胞，PBS重悬细胞并计数，取约5～10万个重悬后的细胞于1 000×g条件下离心5 min，弃上清，加入500µL Binding buffer对细胞进行重悬；加入5µL Annexin V-APC染色液并轻轻混匀；继续加入5µL 7-AAD染色液，轻轻混匀，将混合物置于室温（20～25℃）条件下避光孵育10～20 min；流式细胞仪检测，以右上象限（Q2）区域和右下象限（Q4）区域所占总比例作为早期与晚期凋亡细胞总百分率。每组重复3次。

1.3 统计学方法 所有数据均采用SPSS 21.0统计学软件进行分析。本研究涉及的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间多重比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OCCLUDIN转染后表达鉴定及其对SPC-A1细胞增殖的影响 2条OCLN siRNA转染后经荧光定量PCR检测后发现，siOCLN组OCCLUDIN mRNA水平较siCtrl组显著降低，差异倍数为248倍。CCK-8实验结果显示，OCCLUDIN被沉默后，siOCLN组细胞在 24、48、72、96和 120 h的光密度（OD）值较control组和siCtrl组均明显降低（P＜0.05），见表2。沉默OCCLUDIN可以显著抑制SPC-A1细胞增殖能力。

2.2 OCCLUDIN对SPC-A1细胞凋亡的影响 各组细胞培养48 h后显示，siOCLN组SPC-A1细胞凋亡率最高，与control组和siCtrl组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图1、表3。

2.3 OCCLUDIN对SPC-A1细胞凋亡相关蛋白表达的影响 Caspase途径和AIF凋亡相关蛋白检测结果显示，siOCLN组Bax、caspase-3、caspase-9、AIF和Cyt C等凋亡相关蛋白较control组和siCtrl组表达明显升高（P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2较control组和siCtrl组表达明显下降（P＜0.05），见图2、表3。OCCLUDIN基因沉默可通过线粒体凋亡途径诱导SPC-A1细胞凋亡。

Tab.2 Effect of OCCLUDIN on the proliferation of SPC-A1 cells表2 OCCLUDIN对SPC-A1细胞增殖的影响（n=3，OD，±s）

Tab.2 Effect of OCCLUDIN on the proliferation of SPC-A1 cells表2 OCCLUDIN对SPC-A1细胞增殖的影响（n=3，OD，±s）

＊＊P＜0.01；a与control组比较，b与siCtrl组比较，P＜0.05

组别control组siCtrl组siOCLN组F 0 h 0.25±0.02 0.24±0.02 0.23±0.01 1.000 24 h 0.64±0.09 0.63±0.08 0.38±0.05ab 11.490＊＊48 h 0.72±0.12 0.71±0.13 0.41±0.06ab 8.003＊＊组别control组siCtrl组siOCLN组F 72 h 0.94±0.16 0.92±0.14 0.54±0.08ab 8.860＊＊96 h 1.46±0.21 1.44±0.19 0.68±0.11ab 19.280＊＊120 h 1.58±0.23 1.57±0.22 0.76±0.12ab 17.22＊＊

2.4 OCCLUDIN通过PI3K/Akt通路调控SPC-A1细胞增殖与凋亡 siOCLN组AKT和PI3K蛋白磷酸化水平较control组和siCtrl组明显降低（P＜0.05），见图3、表3。

3 讨论

肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，目前是全球最为常见的肿瘤［5］。传统放化疗治疗方式存在缓解率、无进展生存期以及总生存期均较低等缺点。目前，分子靶向治疗用于治疗肺癌已成研究热点，本研究主要是探寻新的靶分子，为研发靶向药物提供依据。目前已有研究报道了OCCLUDIN在不同肿瘤发生发展中的生物学作用，其在不同肿瘤中所表现的生物学效应各不相同。Martin等［2］发现乳腺肿瘤中OCCLUDIN表达减少。朱克超等［3］检测出OCCLUDIN在食管鳞状细胞癌组织中的表达水平明显低于手术切缘正常食管黏膜组织。而Phattarataratip等［4］发现，有部分口腔鳞状细胞癌患者组织标本存在OCCLUDIN表达量升高现象。同时 ，Rachow 等［6］发 现 人 皮 肤 鳞 状 细 胞 癌 中OCCLUDIN表达正常。Bouchagier等［7］发现原发性肝癌组织中OCCLUDIN表达较癌旁组织明显升高。上述研究结果提示，OCCLUDIN的表达异常可能与肿瘤的发生、发展和预后有关，且表现的生物学效应各异。目前，OCCLUDIN在非小细胞肺癌中的生物学作用及其具体的分子机制尚不清楚。

本研究结果提示OCCLUDIN对SPC-A1细胞增殖具有促进作用。目前研究发现，OCCLUDIN对肿瘤细胞增殖也具有抑制作用，Someya等［8］研究显示，OCCLUDIN在正常子宫内膜、子宫内膜增生和Ⅰ级子宫内膜癌等组织中均有一定的表达量，而在Ⅱ级、Ⅲ级子宫内膜癌组织表达量极低。本研究结果与Someya等［8］研究报道相反，推测可能是由于OCCLUDIN在肿瘤发生发展中的调控机制与多种因素有关，如OCCLUDIN基因沉默后可能引起抑制SPC-A1细胞增殖的细胞因子表达水平升高或者促进SPC-A1细胞增殖的细胞因子表达水平降低，进而最终引起的效应是SPC-A1细胞的增殖被抑制。

Fig.1 Effect of OCCLUDIN on the apoptosis rate of SPC-A1 cells图1 OCCLUDIN对SPC-A1细胞凋亡率的影响

Tab.3 Effects of OCCLUDIN on the apoptosis and signal pathway of SPC-A1 cells表3 OCCLUDIN对SPC-A1细胞凋亡与信号通路的影响 （n=3，±s）

Tab.3 Effects of OCCLUDIN on the apoptosis and signal pathway of SPC-A1 cells表3 OCCLUDIN对SPC-A1细胞凋亡与信号通路的影响 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与control组比较，b与siCtrl组比较，P＜0.05

组别control组siCtrl组siOCLN组F凋亡率（%）9.40±0.60 9.10±0.50 27.40±2.10ab 196.900＊＊凋亡相关蛋白（OD）Bax 0.48±0.06 0.47±0.05 0.64±0.09ab 5.768＊Bcl-2 0.63±0.08 0.64±0.09 0.41±0.04ab 9.447＊＊caspase-3 0.21±0.01 0.29±0.02 0.58±0.07ab 63.170＊＊caspase-9 0.42±0.04 0.38±0.03 0.60±0.08ab 13.890＊＊AIF 0.65±0.09 0.57±0.07 0.98±0.12ab 15.510＊＊Cyt C 0.18±0.01 0.17±0.01 0.71±0.09ab 103.500＊＊PI3K/Akt通路蛋白（OD）p-AKT/AKT 0.54±0.08 0.53±0.08 0.21±0.02ab 24.020＊＊p-PI3K/PI3K 0.89±0.03 0.98±0.06 0.48±0.02ab 130.500＊＊

Fig.2 Effects of OCCLUDIN on apoptosis-related protein expressions of SPC-A1 cells图2 OCCLUDIN对SPC-A1细胞凋亡相关蛋白表达的影响

Fig.3 Effects of OCCLUDIN on AKT/PI3K signaling pathway of SPC-A1 cells图3 OCCLUDIN对SPC-A1细胞AKT/PI3K信号通路影响

本研究发现siOCLN组与control组和siCtrl组比较凋亡率明显升高，siOCLN组Bax、caspase-3、caspase-9、AIF和Cyt C等凋亡相关蛋白较control组和siCtrl组表达明显升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2较control组和siCtrl组表达明显下降，提示OCCLUDIN基因可能通过线粒体凋亡途径抑制SPC-A1细胞凋亡。而有研究发现，OCCLUDIN可通过增加癌细胞对氧化应激的敏感性或增强抑癌基因的表达等方式诱导乳腺癌细胞凋亡［9］，与本研究结果相反，推测可能也是与多种因素有关，如有研究发现肿瘤微环境中的白细胞介素（IL4）会促进肝细胞癌（HCC）肿瘤细胞增殖和抑制其凋亡［10］，OCCLUDIN可能会对促进或抑制肿瘤细胞的一些细胞因子表达有影响，而这些细胞因子作用于SPC-A1细胞的最终效应可能是促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。

多项研究显示，PI3K/Akt信号转导通路的激活在诱导细胞的增殖、分化，参与血管形成，抑制细胞凋亡，以及维持细胞恶性生物学特性方面起重要作用［11-14］。本研究显示，siOCLN组AKT和PI3K蛋白磷酸化水平较control组和siCtrl组明显降低，提示OCCLUDIN可能激活AKT/PI3K通路调控SPC-A1细胞增殖与凋亡过程。今后笔者将进一步通过加入信号通路抑制剂对研究结论进行反证。

综上所述，OCCLUDIN可能通过调控AKT/PI3K通路促进非小细胞肺癌SPC-A1细胞增殖和抑制其凋亡。