柳光芬，姚春艳

(1.武警重庆市消防总队医院检验科，重庆 401120；2.陆军军医军医大学第一附属医院输血科，重庆 400038)

人胎盘绒毛癌简称绒癌，由滋养层细胞癌变而来，具有高度的增殖和侵袭能力的妇科恶性肿瘤[1]。在前期研究中发现，使用40 mmol/L二甲双胍可以通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路调控凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达，促进绒癌细胞凋亡[2]。既往研究表明，AMPK/mTOR信号通路也参与调控了肿瘤细胞的上皮间质转化过程(EMT)，而EMT是导致上皮来源的肿瘤细胞向身体其他器官转移的重要原因，抑制EMT能够显著降低肿瘤细胞的转移能力，提高患者的远期生存率[3-6]。人绒癌为滋养层来源的肿瘤，具有高度的侵袭性，因此如何有效抑制其转移过程是绒癌患者治疗的关键点。本研究以人绒癌细胞JAR为实验对象，旨在探讨二甲双胍对绒癌细胞侵袭和迁移能力的影响，并明确EMT通路中上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)等蛋白的变化趋势和效应方式，为二甲双胍治疗绒癌并抑制其转移提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人胎盘绒毛癌细胞系JAR购置于中国科学院细胞库。胎牛血清(FBS)购于以色列BI公司；1640培养基购于美国Gibco公司；AMPK、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、E-cadherin、 N-cadherin、 Vimentin等蛋白抗体购于美国abcam公司，β-肌动蛋白购于中杉金桥公司。FlouroBlok cell culture transwell小室购于美国Corning公司；Matrigel胶购于美国BD公司。蛋白提取试剂盒及BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天公司。荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪CFX96购于美国Bio-Rad公司；倒置相差显微镜TS-100F购于日本Nikon公司；活细胞工作站Cytation 5购于美国Bio-Tek公司；化学发光成像仪G:box 购于美国Gene公司。

1.2 细胞培养 绒癌细胞系JAR使用含10% 胎牛血清和100 U/mL青霉素和链霉素的1640培养基培养，放置于5%二氧化碳浓度的饱和湿度培养箱，2～3 d换液，待细胞密度为80%左右时使用0.25%的胰酶消化传代。二甲双胍使用前期研究中筛选的最适浓度40 mmol/L处理细胞24 h，随后进行各项检测，以添加二甲双胍做处理的细胞为实验组，未做任何处理的细胞为对照组。

1.3 划痕实验检测细胞迁移 将JAR细胞接种于6孔板中，待细胞融合度大于80%时使用200 μL枪头垂直于细胞生长面划出等宽度整齐无细胞带，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次以去除细胞碎片。随后加入终浓度40 mmol/L的二甲双胍到处理细胞，使用倒置显微镜采集培养0、6、12、24 h时图像。观察各细胞迁移情况，随机测量5点垂直于划痕方向的宽度，计算5点的均值作为实验的初始划痕宽度值并计算细胞迁移速率。细胞迁移速率(%)=(初始划痕宽度值-相应点划痕宽度值)/初始划痕宽度值×100%。

1.4 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 使用FlouroBlok cell culture transwell小室，在上室的膜上铺50 μL的基质胶并待其凝固。使用Hocheest33242染色贴壁JAR细胞，然后使用胰酶消化并用无血清培养基重悬调整细胞浓度为1×105个/mL。取200 μL接种于上室中并加入终浓度为40 mmol/L的二甲双胍，下室中加入700 μL含10% FBS的1640培养基持续培养24 h。使用BioTek Cytation5活细胞工作站拍摄24 h时穿过聚对苯二甲酸乙二酯 (PET)膜的细胞图片，选择3个复孔计数细胞并计算均值和标准差。细胞迁移实验不铺设基质胶，其余步骤和侵袭实验相同。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应检测mRNA表达变化 二甲双胍处理JAR细胞24 h后，提取各组细胞RNA并逆转录为cDNA备用。PCR引物使用NCBI网站上Primer-BLAST进行设计，引物序列见表1，使用Syber-green法检测的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和AMPK的mRNA表达水平，并用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参。把对照组mRNA的表达量设为1，根据2-ΔΔCt计算实验组mRNA相对表达量的变化。

表1 基因引物信息

1.6 免疫蛋白印记法检测蛋白变化 提取细胞总蛋白后使用二喹啉甲酸(BCA)法对其定量，等量蛋白40 μg上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。AMPK、p-AMPK、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等蛋白抗体浓度均为1∶1 000，GAPDH浓度为1∶2 000。一抗4 ℃过夜后二抗(1:5 000)室温孵育1 h后采用化学发光法系统显色，使用Bio-rad软件分析各条带的灰度值。

2 结 果

2.1 二甲双胍抑制JAR细胞迁移 使用前期实验筛选的最佳作用浓度40 mmol/L的二甲双胍处理，发现对照组随着时间的推移，细胞间的划痕逐渐愈合；6～12 h的二甲双胍处理对JAR细胞迁移率无明显影响和对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；24 h的二甲双胍能够有效抑制JAR细胞的迁移速率，实验组和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、2 。

图1 划痕实验检测对照组和实验组的迁移能力

注：**P<0.05，与对照组比较

图2 二甲双胍对细胞迁移能力的影响

2.2 二甲双胍处理对细胞侵袭和迁移能力的影响 使用40 mmol/L的二甲双胍处理荧光标记细胞核并采集穿过PET膜的细胞图像，进行整板扫描并拼接每个视野以便得到整张PET膜的图像，使用软件自动计数分析每张膜上的细胞数。发现侵袭实验中对照组细胞数为(2 638±337)个，二甲双胍处理可以减少穿膜细胞数为(1 251±201)个，差异有统计学意义(P<0.05)；迁移实验中对照组细胞数为(3 341±428)个，二甲双胍处理能够显著抑制迁移过PET膜的细胞数量，对照组穿膜细胞数为(1 852±324)个，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、4。

注：A.对照组迁移；B.对照组侵袭；C.实验组迁移；D.实验组侵袭

图3 Transwell小室检测对照组和实验组侵袭和迁移能力

2.3 二甲双胍调控侵袭迁移相关基因表达 使用荧光定量PCR检测二甲双胍处理前后可能参与肿瘤细胞侵袭和迁移能力的相关基因mRNA的表达。发现二甲双胍能够增加AMPK的mRNA表达(P<0.05)，同时显著上调EMT相关基因E-cadherin(P<0.05)；下调N-cadherin(P<0.05)和Vimentin(P<0.05)的表达，提示二甲双胍能够调控EMT相关基因mRNA表达。见图5。

注：*P<0.05，与对照组比较；**P<0.05，与对照组比较

图4 二甲双胍处理对细胞侵袭和迁移能力的影响

注：**P<0.05，与对照组比较

图5 二甲双胍对AMPK和EMT相关基因mRNA表达的影响

图6 实验组和对照组的蛋白表达变化

注：*P<0.05，与对照组比较；**P<0.05，与对照组比较

图7 二甲双胍对AMPK和EMT相关蛋白表达的影响

2.4 二甲双胍调控侵袭迁移相关蛋白表达 使用免疫蛋白印记法技术检测二甲双胍处理前后参与肿瘤细胞侵袭和迁移能力的相关蛋白的变化情况。发现其AMPK总蛋白水平没有明显变化，促进AMPK Thr172位点的磷酸化(P<0.05)；同时上调EMT相关蛋白E-cadherin(P<0.05)，下调N-cadherin (P<0.05)、Vimentin(P<0.05)的表达，从而抑制上皮间质转化的过程。见图6、7。

3 讨 论

人绒癌细胞系JAR是一种胚胎滋养层上皮来源并且具有高度的侵袭能力恶性肿瘤细胞，其患者最终往往死于肿瘤细胞的脑转移，有报道指出EMT可能是主导绒癌细胞侵袭和转移的主要因素[7]。在前期研究中发现二甲双胍可以促进绒癌细胞凋亡的发生[2,8]，并初步阐明其通过AMPK/mTOR信号通路调控绒癌细胞凋亡的分子机制。进一步分析文献发现，AMPK可以抑制EMT过程并逆转肿瘤细胞的间质表型[9-10]，从而抑制肿瘤细胞的转移。因此，本研究拟探索二甲双胍对绒癌细胞EMT，迁移和侵袭能力的影响及可能的分子机制，以期为二甲双胍的抗肿瘤治疗提供新的思路和方法。

侵袭和转移的能力是肿瘤细胞典型特征之一[11]，也是恶性肿瘤难以根治的原因，在此过程中EMT扮演着十分重要的角色。有研究表明，E-cadherin向 N-cadherin转化是EMT发生的重要机制，E-cadherin下调或缺失会导致上皮细胞极性消失、细胞间的黏附能力减弱，从而获得间质细胞表型[12-13]。E-cadherin和 N-cadherin这种此消彼长的关系随着肿瘤病理分级的增高非常明显[14]。Vimentin也是EMT的重要标志物，Vimentin只在间质细胞中特异表达，因此肿瘤细胞表达Vimentin则提示其为间质细胞肿瘤。本研究发现，二甲双胍能够上调E-cadherin，同时下调N-cadherin和Vimentin蛋白的表达，抑制绒癌JAR细胞迁移和侵袭能力。提示二甲双胍可以通过逆转绒癌JAR细胞EMT的表型从而抑制其转移的发生。

二甲双胍是一种临床上常用的AMPK激活剂，本研究发现，其在抑制绒癌JAR细胞EMT的过程中，促进了p-AMPK Thr172的磷酸化。AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能够增加细胞的分解代谢从而产生大量ATP，因此AMPK信号通路是非常经典的细胞代谢调控通路[15]。目前，多项研究表明二甲双胍激活AMPK后能够通过多种下游调节因子影响肿瘤细胞的EMT过程：在甲状腺癌中mTOR处于活化状态，经过二甲双胍处理能够抑制mTOR及其下游p70s6k和4E-BP1的磷酸化，从而抑制EMT过程[16]。此外二甲双胍也通过mTOR下调肾癌细胞自噬而达到抑制EMT的作用[17]；另一方面，二甲双胍激活AMPK后可以抑制ERK信号通路的活化，影响SNAI家族成员snail和slug的表达从而上调E-cadherin进而抑制EMT的发生[18]；二甲双胍还能够激活AMPK并影响细胞内部活性氧及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NADPH oxidase 4)，从而抑制细胞EMT的进程，活化后的AMPK还能够抑制TGF-β、血管收缩素2、醛固酮及清蛋白等诱导的EMT[19]。

4 结 论

本研究发现，二甲双胍能够抑制绒癌JAR细胞株侵袭和迁移的能力。其可能涉及的分子是二甲双胍使AMPK磷酸化激活，上调E-cadherin并下调N-cadherin和Vimentin，以实现逆转EMT的发生。结合前期研究中二甲双胍通过AMPK/mTOR通路促进绒癌细胞凋亡，提示二甲双胍促进绒癌细胞凋亡、抑制侵袭和转移，为下一步临床试验提供了理论和实验基础。