王 宁，杨春菊，何丽囡，樊保敏，曾广智，尹俊林

(云南民族大学 云南民族大学-香港浸会大学传统天然药物研发联合实验室,云南 昆明 650500)

青蒿素(artemisinin)是一种来源于黄花青蒿(ArtemisiaannuaL.)的含过氧桥的倍半萜内酯，其被广泛用来治疗多药耐药株恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)引起的疟疾[1].近些年来的研究发现，青蒿素及其衍生物可以抑制肿瘤细胞，包括人白血病细胞株[2]、结肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、中枢神经系统和肾脏癌细胞系，其中对白血病和结肠癌细胞株具有较高的抑制活性[3].

弥散性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphomas，DLBCL)是一种主要发生在淋巴造血系统的恶性肿瘤，是非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin造血系统的恶性肿瘤 L，NHL)中的一种主要亚型，约占所用非霍奇金淋巴瘤的三分之一[4].弥散性大B细胞淋巴瘤主要有3种亚型，分别为预后较好的表达正常生发中心B细胞特征基因的生发中心B细胞样型(GCB)；预后较差，表达活化的外周血B细胞和浆细胞特征基因的活化B细胞型样(ABC)；第3型为无明确特征的异源性类型，预后较差.目前，使用标准的一线治疗方案利妥昔单抗+CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松)后，DLBCL 患者的 4 年总生存率为 60%～70%，但仍有30% 的患者产生耐药或复发转移现象[5]，因此急需寻找新的治疗药物来提高复发难治性DLBCL 患者的生存率.

阳离子转运蛋白样蛋白1(CHAC1)是细菌、酵母和哺乳动物细胞中高度保守的蛋白质，据报道CHAC1是ATF4/ATF3/CHOP途径下游的细胞溶质蛋白，是一种新型的促凋亡因子，参与内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ER)中的未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction，UPR)[6-7].最近的一些报道还表明CHAC1消耗细胞中的谷胱甘肽(GSH)，且在此过程中具有γ-谷氨酰基环转移酶活性[8-9].谷胱甘肽作为抗氧化剂调节细胞中的氧化平衡，而CHAC1蛋白的过表达使细胞内的谷胱甘肽过度消耗，进而使细胞内活性氧过度积累，从而促进细胞的死亡.然而，CHAC1在青蒿素引起的弥散性大B细胞淋巴瘤细胞中的作用机制仍不清楚，有待进一步了解.

青蒿素的抗肿瘤作用是目前研究的一个热点，为了进一步探究青蒿素诱导的弥散性大 B 细胞淋巴瘤细胞增殖抑制过程中CHAC1基因作用及相关机理，我们通过慢病毒转染的手法，获得了沉默CHAC1基因的稳转细胞株，并利用沉默CHAC1基因的稳转细胞株，初步探讨了CHAC1基因在青蒿素抑制弥散性大B细胞淋巴瘤细胞增殖中的作用，为青蒿素引起的弥散性大 B 细胞淋巴瘤的增殖抑制作用机理及难治型DLBCL新药的开发提供了新的理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验所用的细胞株

SU-DHL-8(人B细胞淋巴瘤细胞)来源于北纳创联生物技术有限公司.

1.2 试剂、药品

1640培养基、胎牛血清、谷氨酰胺购自以色列Biological industries公司；MTT粉末购自美仑生物公司；30%丙烯酰胺溶液、1.5 mol/L Tris(PH 8.8)、1.5 mol/L Tris(pH 6.8)、甘氨酸均购自生工生物有限公司；TEMED购自上海BBI 生命科学有限公司；化学发光检测试剂盒购自Millipore生物公司；青蒿素购自上海阿达玛斯试剂有限公司；CHAC1兔源一抗(ab76386)购自abcam生物公司；HRP标记的二抗购自上海BBI 生命科学有限公司；瞬时转染的siRNA及稳定转染的shRNA均购自上海吉玛制药技术有限公司；RIPA裂解液、嘌呤霉素盐酸盐购自上海翊圣生物科技有限公司；UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒购自生工生物有限公司；Hifair Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Super MiX for qPCR、2×Hieff PCR Master Mix(With Dye) 、Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus) 试剂盒均购自上海翊圣生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯.

1.3 仪器

imark型酶标仪(伯乐，美国)；DMi8型倒置荧光显微镜(徕卡，德国)； Quant Studio 5型实时定量PCR仪(赛默飞世尔，美国)；Eppendrof 5424R型低温高速离心机(艾本德，德国)；1658001型垂直电泳带转印系统(伯乐，美国)； Tanon 5200型化学发光成像仪(天能，中国上海)； Thermo Scientific 3425型二氧化碳细胞培养箱(赛默飞世尔，美国).

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养

本实验所采用的人弥散性大B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-8为悬浮细胞，按照购买说明所述，细胞使用10%含牛胎血清1 640培养基，在37 ℃， 5% CO2的细胞培养箱内培养.

1.4.2 青蒿素对弥散性大B细胞淋巴瘤细胞增殖的抑制活性分析

收集对数增长期的SU-DHL-8细胞，离心，计数，接种于96孔板，并将已经配制好的青蒿素储备液(10 mol/L)分别稀释到5个不同的浓度(100、20、4、0.8、0.16 μmol/L)，分别将不同浓度的药物依次加入96孔板中，培养箱内孵育48 h之后，每孔加入5 mg / mL MTT溶液，继续孵育4 h，吸出板内的细胞液，加入100 μL DMSO溶解甲瓒，用普通酶标仪于570 nm处测定OD值，并计算抑制率.

1.4.3 qPCR测定基因的表达情况

将处于对数生长期的细胞收集离心、重悬计数，并将其接种于不同的细胞培养皿中，细胞密度为5×106个/皿，分别分为实验组和对照组，两组同时做时间梯度(2、24 h)，实验组加入青蒿素，终浓度为10 μmol/L，对照组加入相同体积的DMSO，按时间梯度收集细胞，提取RNA，再逆转录为cDNA，再通过扩增，qPCR等操作分析相关基因的表达情况.

1.4.4 Western blot检测CHAC1蛋白的表达

将处于对数生长期的细胞收集计数，并接种于6孔板内，细胞密度为5×105个/孔，实验组分别加入不同浓度的样品处理24 h，对照组加入相同体积的DMSO,收集细胞加入裂解液冰上裂解40 min，10 000 g，4 ℃离心10 min，取上清测定并调节蛋白浓度，使蛋白浓度相等，再将蛋白加入上样缓冲液95 ℃变性5 min，离心，取上清上样，样品经SDS-PAGE电泳分离后，分离胶湿法转印于PVDF膜上，用含5%的脱脂奶粉TBST溶液封闭2 h，4 ℃敷一抗过夜，洗膜30 min，10 min/次;二抗1 h，洗膜30 min，10 min/次，将显影液覆盖洗好的膜避光孵育5 min，除去显影液，用保鲜膜把膜包好，放入化学发光仪中显影.

1.4.5 siRNA瞬时转染细胞模型的构建

1) siRNA片段的设计 根据要求设计合成的沉默CHAC1基因和SiRNA共有3个，编号及序列如表1所示.

表1 siRNA的相关信息

2) siRNA转染步骤 收集对数生长期的细胞并接种于6孔板内，细胞密度为(2～5)×106个/孔，取1 μL/孔lipofectamine 2 000(使用前轻轻摇匀)，用200 μL Opti-MEM稀释，轻轻混合后，室温孵育5 min，取2 μL 荧光标记的FAM siRNA或目标siRNA用200 μL Opti-MEM稀释，轻轻混合均匀，室温孵育20 min，将混合好的转染物加入6孔板内，400 μL/孔，(37 ℃，5% CO2)培养24 h，取适量荧光标记的FAM siRNA转染的细胞于荧光显微镜下检测转染效率.

1.4.6 shRNA稳定转染细胞模型的构建

1)shRNA的相关信息 CHAC1的核苷酸序列为5′-GATCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGA ACGT-GACACGTTCGGAGAACTTTTTTG-3′；Control为慢病毒干扰空载体LV3(H1/GFP & Puro).

2) shRNA的转染步骤 收集对数生长期的细胞，计数并接种于96孔板(方法参照MTT实验)，用无菌EP管稀释1×108TU/mL的病毒原液分别为1，10、100倍；并将其分别加入孔板中，每孔10 μL(病毒终浓度相当于分别稀释10、100、1 000倍)；37 ℃，5% CO2孵育8～12 h后观察细胞形态(无明显差异)，分别在感染24、48、72、96 h后观察荧光表达情况，确定合适转染浓度.将配置好的嘌呤霉素盐酸盐的储备液(8 mg/mL)分别稀释至0.5、1、2、4、8 μg/mL的工作液并加入96孔板中培养24 h，分别对每个质量浓度梯度的细胞进行计数，确定嘌呤霉素盐酸盐的最小使用度量浓度(2 μg/mL)，对慢病毒转染的细胞进行培养、传代，每传一代向细胞培养皿中加入嘌呤霉素盐酸盐，使每皿的终质量浓度为2 μg/mL，这样就得到了逐代富集的稳转细胞株，需要注意的是，实验过程中的稳转细胞株不需要再加入嘌呤霉素盐酸盐，以免影响实验效果.

1.5 统计方法说明

文中数据平均值通过至少3次独立实验结果计算而得，误差线用标准误差(±SE)表示，统计学比较采用双尾t检验，统计学显著性数据用星号表示，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

2 结果与分析

2.1 青蒿素对弥散性大B细胞淋巴瘤的增殖抑制作用

MTT法测定细胞活性的结果如图1a所示，青蒿素对弥散性大B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-8增殖有明显的抑制效果，青蒿素的结构如图1b.分别取不同用药浓度的细胞用荧光显微镜观察明场下细胞的密度并拍照如图1c，与不加药组相比，细胞的增殖受到明显的抑制且具有浓度依赖性，和活性的测定结果一致.

2.2 青蒿素对CHAC1基因和蛋白的表达影响

采用qPCR的方法分析实验组和对照组的CHAC1基因表达影响，结果如图2a所示，与对照组相比实验组中CHAC1基因的表达在2 h的时候无明显区别，但在24 h的时候，实验组中CHAC1基因的表达明显上调.采用Western Blot蛋白免疫印迹的方法分析青蒿素作用于弥散性大B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-8后CHAC1蛋白的表达情况如图2b所示，在青蒿素刺激细胞24 h后，与对照组相比，实验组中CHAC1蛋白的表达明显提高.

qPCR基因表达值至少3次独立实验结果计算而得，误差线用标准误差(±SE)表示，统计学比较采用双尾t检验，统计学显著性数据用星号表示，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

2.3 siRNA瞬时转染细胞株的构建

siRNA感染细胞株之后转染效率如图3a所示，用荧光倒置显微镜分别在明场及荧光488 nm处拍摄，(荧光强度越强转染效率越高)3个siRNA的转染效率均>70%，对转染的细胞进行基因表达分析如图3b，与对照组相比(转入FAM siRNA)，转入沉默CHAC1的siRNA后，CHAC1基因的表达明显下调；Western Blot实验测定CHAC1蛋白的表达情况如图3c，CHAC1蛋白表达减少；采用MTT实验测定青蒿素对转染后细胞株的增殖抑制结果如图3d，与转入FAM siRNA的细胞相比，青蒿素对转入沉默CHAC1的siRNA细胞的增值抑制作用下降.这表明青蒿素对弥散性大B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-8的增殖抑制作用和CHAC1基因的表达相关.平均值通过至少3次独立实验结果计算而得，误差线用标准误差(±SE)表示，统计学比较采用双尾t检验，统计学显著性数据用星号表示，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

2.4 shRNA稳定转染细胞模型的构建

shRNA感染细胞后荧光显微镜下观察转染效率如图4a，用荧光倒置显微镜分别在明场及荧光488 nm处拍摄，(荧光强度越强转染效率越高)Control组和shRNA：CHAC1组的转染均效率 > 90%.对转染的细胞进行基因表达分析如图4b，与Control组相比，转入沉默CHAC1的shRNA后，CHAC1基因的表达明显下调；Western Blot实验测定CHAC1蛋白的表达情况如图4c，沉默CHAC1基因后CHAC1蛋白的表达减少；采用MTT实验测定青蒿素对转染后细胞株的增殖抑制结果如图4d，与Control组的细胞相比，青蒿素对转入沉默CHAC1的shRNA细胞的增值抑制作用下降.这表明青蒿素对弥散性大B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-8的增殖抑制作用和CHAC1基因的表达相关.平均值通过至少3次独立实验结果计算而得，误差线用标准误差(±SE)表示，统计学比较采用双尾t检验，统计学显著性数据用星号表示，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

采用2种不同形式的转染方法转染后，siRNA及shRNA的转染效率均>70%，视为有效转染，将转染后的细胞分别进行基因表达分析及蛋白表达水平检测，结果均显示转染沉默CHAC1基因的RNA片段后，SU-DHL-8细胞内CHAC1基因及蛋白的表达均下降， MTT实验对转染的细胞株进行活性分析，结果表明选择性沉默CHAC1基因后青蒿素对弥散性大B细胞淋巴瘤SU-DHL-8细胞的增值抑制作用下降.

3 讨论

MTT实验结果中，青蒿素对弥散性大B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-8有明显的增殖抑制效果，进一步的基因及蛋白表达分析表明，在对弥散性大B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-8的增殖抑制过程中，青蒿素上调了CHAC1基因及蛋白的表达.这些结果说明CHAC1基因可能参与到青蒿素对弥散性大B细胞淋巴瘤增值抑制的作用机理中.

接着，我们采用沉默CHAC1基因的siRNA对SU-DHL-8细胞进行转染实验，在验证了转染效率之后，对转染后的细胞的基因表达进行分析，结果表明，与对照组相比，在沉默CHAC1基因之后，细胞内的CHAC1基因表达下调；对转染的细胞进行蛋白表达分析，与对照组相比，CHAC1基因沉默后，CHAC1蛋白的表达水平降低；这说明siRNA转入细胞后确实达到了沉默CHAC1基因的效果；我们同样对转染后的细胞进行活性分析，MTT实验结果表明，在沉默CHAC1基因后，青蒿素对淋巴瘤细胞的增长抑制作用降低.这个结果进一步验证了之前的分析.

课题组接着设计了和siRNA瞬时转染相同实验的稳定转染实验，采用携带稳定沉默CHAC1基因的慢病毒感染SU-DHL-8细胞，基因和蛋白表达分析结果表明转染达到了预期的沉默效果，活性分析结果表明沉默掉CHAC1基因后，青蒿素对细胞株的增长抑制作用降低.稳定转染实验结果和瞬时转染的结果一致.这说明CHAC1基因在青蒿素对弥散性大B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-8增殖抑制中扮演着重要的角色.

通过建立转染细胞株的模型，对CHAC1基因在青蒿素引起的弥散性大B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-8的增殖抑制作用中的表达情况进行了初步分析，印证了之前实验的结果，在以往的研究中，青蒿素在抑制肿瘤细胞增殖过程中CHAC1基因的作用未见报道，而课题组的研究发现，青蒿素在对DLBCL细胞的增殖抑制中上调了CHAC1基因的表达，且沉默CHAC1基因后，青蒿素对DLBCL细胞的增殖抑制作用减弱，说明CHAC1基因在青蒿素抗肿瘤作用机理中有一定的作用，我们的发现对进一步研究CHAC1基因的作用及青蒿素对肿瘤细胞的抑制作用机理提供了新的思路和方法，和瞬时转染相比，稳定转染能长时间保存转染细胞模型，有利于对作用机理的长时间研究.