居来提·艾买提 阿布都沙拉木·阿布都热衣木 热孜万古丽·吐尔汗

(新疆医科大学附属中医医院 1干部二科，新疆 乌鲁木齐 830000；2老年病科)

血管重构是高血压最为关键的病理变化，研究证明，高血压患者的血管重构几乎影响所有组织器官，高血压血管重构一般为血管胶原重构〔1,2〕。机体血管胶原重构是血管对刺激的复杂的动态反应过程，最终使血管产生胶原结构和数量变化〔3〕。研究证实姜黄素具有十分理想的心血管保护作用〔4〕。能显著抑制胶原合成相关细胞的功能，大幅度控制胶原含量〔5〕。高血压血管内皮细胞自噬水平紊乱与胶原水平存在相关性〔6〕。本研究观察姜黄素对血管紧张素Ⅱ诱导的高血压模型小鼠血管胶原重构的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 采用野生型C57BL/6小鼠，共40只，雄性，鼠龄8 w，体重18～22 g。小鼠均置于有温控(20～25℃)清洁通风的动物房中饲养。所有小鼠取材前禁食12 h，自由进水。

1.2实验试剂 姜黄素、血管紧张素Ⅱ购自美国Sigma公司。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、西罗莫司靶蛋白(mTOR)、Bax、Bcl-2及活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3抗体购自美国Abcam公司。磷酸化(p)-PI3K、p-AKT及p-mTOR抗体购自美国BD公司。

1.3实验分组 小鼠随机分为4组，每组10只。对照组接受磷酸盐缓冲液(PBS)微量泵注(剂量同血管紧张素Ⅱ组)；血管紧张素Ⅱ组接受血管紧张素Ⅱ微量泵注〔1 500 ng/(min·kg)，7 d〕建立高血压模型〔7〕；姜黄素组接受姜黄素腹腔注射干预〔200 mg/(kg·d)，7 d〕〔6〕;双干预组接受血管紧张素Ⅱ微量泵注〔1 500 ng/(min·kg)，7 d〕+姜黄素腹腔注射干预〔200 mg/(kg·d)，7 d〕。

1.4血管紧张素Ⅱ诱导高血压模型 按照18～22 g体重小鼠灌泵7 d计算，微量泵释放血管紧张素Ⅱ的速率为1 500 ng/(min·kg)，每只微量泵可容纳90 μl的血管紧张素Ⅱ，计算出血管紧张素Ⅱ的浓度(288～320 μg/L)。使用异氟烷气体麻醉小鼠，用干净的眼科剪剪开小鼠背部皮肤约2 mm小口，缓慢地将灌好血管紧张素Ⅱ和PBS的微量泵埋入小鼠皮下，使用眼科线缝合伤口。血管紧张素Ⅱ灌注术后第4天开始监测小鼠血压，直到术后第7天，以确定血管紧张素Ⅱ灌注成功。术后第7天取材。

1.5苏木素-伊红(HE)染色 取小鼠主动脉进行石蜡切片，脱蜡至水干；苏木素染色2 min；使用PBS冲洗浮色；0.5%盐酸酒精分化，自来水冲洗。伊红染色1 min，使用PBS冲洗浮色；乙醇梯度脱水；石蜡切片固定。中性树胶封片，显微镜下照片。HE染色后采用BI2000医学图像分析系统，40倍显微镜下测定各组小鼠胸主动脉中膜厚度(MT)、管腔内径(LD)，按顺时针方向测12个平均值，并计算MT/LD。

1.6Masson染色方法 取小鼠主动脉进行石蜡切片，脱蜡至水干；5%天青石兰染色5 min，使用PBS冲洗浮色。苏木素染色3 min，使用PBS冲洗浮色。使用丽春红∶酸性品红=1∶2，染色20 min；1%光绿染色4 min；乙醇梯度脱水；石蜡切片固定。中性树胶封片，显微镜下照片。石蜡切片进行Masson染色，采用BI2000医学图像分析系统。

1.7Western印迹 取部分主动脉血管组织，加入裂解液，2 h后加入稀释过的相应抗体(1∶500)，在4℃下过夜；然后加入二抗并在室温下孵育1 h，加入发光底物，通过Gene Box成像系统进行曝光，并记录反应条带的数目，用Quantity One软件分析同一样本中蛋白与内参甘油醚-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白条带的灰度值之比。

1.8统计学分析 应用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组血压及胶原含量比较 与对照组相比，血管紧张素Ⅱ组血压显著升高(P<0.05)。双干预组血压增幅较低，高血压进展慢于血管紧张素Ⅱ组。姜黄素组血压与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，血管紧张素Ⅱ组主动脉胶原含量显著增加(P<0.05)。与血管紧张素Ⅱ组相比，双干预组主动脉胶原含量显著降低(P<0.05)。见图1、表1。

图1 各组主动脉Masson染色(×40)

组别收缩压(mmHg)舒张压(mmHg)胶原纤维含量对照组99.0±5.070.0±6.013.1±2.2血管紧张素Ⅱ组123.0±9.01)87.0±8.01)32.5±6.51)姜黄素组95.0±6.02)67.0±5.02)19.6±6.72)双干预组111.0±12.01)2)89.0±7.01)15.8±3.22)

与对照组比较：1)P<0.05；与血管紧张素Ⅱ组比较：2)P<0.05；下表同

2.2各组主动脉MT、LD及MT/LD比值比较 与对照组相比，血管紧张素Ⅱ组MT、LD及MT/LD比值显著升高(P<0.05)。与血管紧张素Ⅱ组比较双干预组MT、LD及MT/LD比值显著降低(P<0.05)。见表2，图2。

2.3各组自噬相关蛋白磷酸化水平比较 双干预组PI3K、AKT及mTOR表达含量与血管紧张素Ⅱ组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，p-PI3K、p-AKT及p-mTOR表达显著低于血管紧张素Ⅱ组(P<0.05)。见表3、图3。

2.4姜黄素影响血管自噬终末事件 与对照组比较，血管紧张素Ⅱ Bcl-2含量显著增加(P<0.05)，Bax和Cleaved Caspase-3的含量显著降低(P<0.05)；与血管紧张素Ⅱ组比较，双干预组显著增加Bax和Cleaved Caspase-3的含量(P<0.05)，显著减少Bcl-2含量(P<0.05)。见表3、图4。

表2 各组主动脉MT、LD及MT/LD比较

图2 各组主动脉染色(HE，×40)

组别PI3KAKTmTORp-PI3Kp-AKTp-mTORBcl-2BaxCleaved Caspase-3对照组1.6±0.61.3±0.51.2±0.40.9±0.40.5±0.20.4±0.20.6±0.21.2±0.41.4±0.3血管紧张素Ⅱ组1.5±0.81.2±0.41.1±0.31.4±0.51)1.1±0.31)0.9±0.31)1.2±0.51)0.2±0.11)0.2±0.11)姜黄素组1.7±0.51.4±0.31.3±0.51.1±0.42)0.7±0.32)0.1±0.12)0.8±0.32)0.7±0.32)1.1±0.32)双干预组1.6±0.71.3±0.41.2±0.20.8±0.22)0.6±0.22)0.3±0.22)0.7±0.12)1.1±0.52)1.2±0.42)

图3 各组Western印迹法检测各组自噬相关蛋白磷酸化水平

图4 Western印迹检测各组主动脉Bax、Cleaved Caspase-3及Bcl-2蛋白

3 讨 论

本研究证实姜黄素能够显著降低高血压病程中的血管胶原重构水平，姜黄素干预改善了包括血管内径及胶原含量在内的多项高血压血管重构等相关指标，且姜黄素能够通过调控PI3K/AKT相关自噬通路减缓高血压血管胶原病变。

研究提示，姜黄素低剂量生活干预能够调控患者昼夜血压节律，轻度降低血压及减少高血压风险〔7,8〕。姜黄素能够显著缩小高血压所致的血管管径病变。研究虽然提示姜黄素能够保护血管系统的稳定性，但多数研究局限于内皮功能，本研究补充了姜黄素对于血管整体稳定性的作用，这对于高血压治疗十分重要〔9,10〕。

主动脉内皮细胞自噬水平异常会直接导致内皮功能紊乱，进而加剧高血压病变程度，而靶向敲除自噬相关基因能够有效稳定血压〔11,12〕。研究报道自噬通路分子的低磷酸化可显著抑制胶原合成〔13〕。本研究发现姜黄素不能影响PI3K、AKT、mTOR等非磷酸化蛋白表达，导致该现象的可能原因有：姜黄素剂量不足；高血压模型建立后干预时间较短(7 d)。因此，我们对自噬下游事件的分子标志物进行了验证，并发现姜黄素可增加Bax和Cleaved Caspase-3的含量，并减少Bcl-2的含量，从而证实了：尽管中等剂量姜黄素干预仅影响高血压病变血管的自噬磷酸化水平，但已经足够影响自噬终末事件，从而最终改善血供胶原重构水平。

综上，姜黄素具有高血压防治潜力，能够通过调控PI3K/AKT自噬通路的磷酸化水平改善高血压病变血管的胶原重构水平。