蔺广荣 刘克毅 李纪男 姜恒 柴芳

(锦州医科大学附属第一医院甲状腺外科，辽宁 锦州 121001)

甲状腺滤泡癌(FTC)是甲状腺癌中第二种常见恶性肿瘤。根据侵袭程度分为两类〔1〕：广泛侵入型FTC(WIFTC)和微小侵入型FTC(MIFTC)，前者对邻近的组织和(或)血管有广泛的浸润，而后者局限于包膜和(或)血管侵犯，两者预后差异明显。Beclin-1属于自噬相关蛋白，对细胞的自噬过程起着重要的调控作用。热休克转录因子(HSF)1是调控热休克蛋白(HSP)表达的重要因子，备受癌症研究者关注〔2〕。本研究通过检测Beclin-1和HSF-1蛋白在FTC及癌旁组织的表达水平，探讨两者与FTC临床病理特征的相关性。

1 资料与方法

1.1临床资料 2004年1月至2017年12月锦州医科大学附属第一医院行手术治疗确诊为FTC的患者53例，男17例，女36例，年龄22～72岁，平均(49.5±20.1)岁。将标本距癌旁≤2 cm的癌旁组织作正常对照。纳入标准：①病理诊断均有两位年资高的病理专家共同确诊；②无甲状腺癌家族遗传史；③术前均未行内分泌治疗及放化疗；④无合并桥本氏病等甲状腺相关疾病；⑤临床分期按照2010年美国癌症联合会(AJCC)分期。本研究经锦州医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准。

1.2试剂与方法 兔抗人Beclin-1(WL02237，Wanleibio，中国)、兔抗人HSF-1(WL01645，Wanleibio，中国)、生物素化山羊抗兔IgG(A0277，Beyotime，中国)、辣根酶标记链酶亲合素(A0303，Beyotime，中国)、DAB显色液(DA1010，Solarbio，中国)。免疫组化采用SABC免疫组织化学法。组织经10%甲醛固定后脱水、包埋，切片厚度4 μm，用于免疫组化检测Beclin-1、HSF-1蛋白表达。一抗均按1∶150稀释，按试剂盒说明书操作，3%双氧水封闭内源性过氧化物酶，微波修复。依次加入一抗及二抗，DAB显色，苏木素复染，常规脱水，透明，中性树胶封片。磷酸盐缓冲液(PBS)取代一抗作为阴性对照。

1.3结果判断 本次实验染色结果由两位经验丰富的病理科医生双盲法独立阅片。根据染色强度和阳性细胞百分比来评分。以出现棕黄色颗粒沉淀为阳性表达。强度评分为0分(无染色)、1分(浅黄色)、2分(棕黄色)和3分(棕褐色)。比例积分为0(<5%阳性细胞)、1(5%～24%阳性细胞)、2(25%～49%阳性细胞)、3(50%～74%阳性细胞)和4(≥75%阳性细胞)。强度评分和比例积分相乘产生了最终的染色评分：-(0分)、+(1～4分)、(5～8分)和(9～12分)。在统计学分析中，-或+最后染色评分被合并到阴性表达，或最后评分被合并到阳性表达。

1.4统计学分析 应用SPSS16.0软件进行χ2检验、Spearman等级相关分析，条件不足者用Fisher确切概率法。

2 结 果

2.1FTC中Beclin-1和HSF-1阳性表达 Beclin-1和HSF-1在FTC中呈棕黄色或棕褐色弥漫性强表达，而在癌旁正常甲状腺组织不表达或局灶弱表达。见图1。两组Beclin-1和HSF-1阳性表达率差异有统计学意义(P<0.001)。见表1。

图1 FTC、癌旁组织中 Beclin-1、HSF-1阳性表达(SABC法，×400)

2.2Beclin-1和HSF-1表达与FTC临床病理参数间的关系 FTC中Beclin-1和HSF-1表达均与病理类型相关(P<0.001)，HSF-1表达与远处转移相关(P<0.05)。见表2。

表1 FTC、癌旁组织中Beclin-1和HSF-1蛋白的阳性表达〔n(%)，n=53〕

表2 FTC中Beclin-1和HSF-1表达与临床特征的关系〔n(%)〕

2.3FTC中Beclin-1和HSF-1表达相关性 Beclin-1和HSF-1表达呈显著正相关(r=0.419，P<0.01)。见表3。

表3 FTC中Beclin-1和HSF-1表达相关性分析(n)

3 讨 论

FTC是起源于甲状腺滤泡上皮的恶性肿瘤，易通过血运发生远处转移，淋巴转移较少见。据统计，10%～15% FTC患者会通过血行转移累及肺、肝、骨〔3〕，11%～39% FTC患者会复发〔4，5〕，很多患者失去了最佳手术时机。

自噬是溶酶体介导的细胞内分解代谢过程，细胞通过清除受损细胞器和长寿蛋白维持细胞内稳态。Beclin-1是自噬通路的重要调节器，能够通过诱发肿瘤细胞自噬使肿瘤细胞持续增殖，在多种肿瘤中过度表达〔6～8〕。本研究发现，自噬相关蛋白Beclin-1在FTC中表达明显高于癌旁组织，进而推测自噬参与了FTC的发生，这一点与既往研究一致〔9〕。本研究还提示自噬可能参与了FTC的发展。笔者推测肿瘤的生存状态和自噬密切程度有关。随着肿瘤侵袭力的增强，自噬可能会帮助肿瘤细胞摆脱应激环境来促进肿瘤的生长。尽管没有发现Beclin-1的表达与远处转移存在相关，笔者考虑主要与纳入的研究对象例数有关。研究表明Beclin-1表达缺失是甲状腺乳头状癌形成过程的重要机制〔10，11〕。但是本研究发现，Beclin-1过度表达参与了FTC的发生与发展。笔者推测自噬在两种类型的甲状腺癌中发病的机制可能存在不同。Cha等〔12〕用免疫的方法检测Beclin-1蛋白在FTC中的表达情况，结果均未表达，笔者认为可能与所选取的病例有关，Cha等〔12〕并未说明所选取病理类型及是否存在远处转移。

HSF-1是热休克反应中最主要的调节因子，通过调控HSP的转录翻译发挥生物学效应。目前已发现HSF-1在人类多种肿瘤中高表达，包括呼吸系统，泌尿系统，消化系统，生殖系统等，已成为多种癌症治疗的潜在靶点〔2〕。本研究结果说明HSF-1可作为FTC发生发展及侵袭转移的关键性调控靶点。董丽涛〔13〕发现HSF-1的表达与子宫内膜癌分化程度、淋巴结转移及浸润的深度有关。Wu等〔14〕发现HSF-1的表达与肾癌的分期有关。而本研究发现HSF-1表达与FTC的病理类型及转移有关。 Jin等〔15〕研究证实敲除HSF-1通过激活AMP活化蛋白激酶(AMPK)活性可以减轻致癌物质对肝脏代谢的不利影响。另有研究证实，HSF-1敲除后，由于RNA结合蛋白人抗原R(HUR)的下调，通过HSF-1/HUR/缺铁诱导因子(HIF)-1通路可以抑制乳腺癌细胞生长与迁徙〔16〕。最新研究发现，HSF-1可以通过调节HSP27的表达来调控MET/ERK信号通路中相关蛋白的表达，促进胃癌细胞增殖分化〔17〕。研究表明HSF-1既可以调控抑制依赖半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)内外源性细胞凋亡通路，又可以促进Bcl-X(L)、Mcl-1和Bcl-2等抗凋亡蛋白的增加，抑制肿瘤细胞的凋亡并促进其增殖分化〔18〕。由此可见，HSF-1通过多种途径参与了肿瘤的发生发展及侵袭转移。HSF-1可以通过促进转录激活肝癌细胞中自噬相关蛋白ATG4B表达〔19〕。笔者推测，热休克反应和自噬可能相辅相成共同参与了肿瘤的发生与发展。