张惠丽 李如尧 马燕 赵信燕

(定西市人民医院呼吸内科，甘肃 定西 743000)

在全球范围内，肺癌是肿瘤致死的重要原因，其具有发病率高、恶性程度高等特点，随着治疗技术的不断进步，肺癌的治疗和诊断虽然取得了巨大进展，但仍然不能满足需求，非小细胞肺癌是肺癌分型中的一种，占全部肺癌患者的85%左右〔1,2〕。靶向基因治疗是近年来肿瘤治疗的热点，其具有准确性高、安全等多种优点，寻找有效的靶基因是目前医学工作者的难点。锌指蛋白(ZNF)217属于锌指蛋白家族，在很多恶性肿瘤中高表达，如胃癌、乳腺癌、肺癌等，ZNF217沉默可以抑制乳腺癌、肝癌等肿瘤细胞的生长，在肿瘤发展中发挥癌基因的作用〔3～7〕。本研究通过Realtime PCR和Western印迹检测ZNF217在非小细胞肺癌细胞和正常人肺上皮细胞中的表达，并通过短发夹RNA(shRNA)干扰非小细胞肺癌细胞中ZNF217的表达水平，探讨沉默ZNF217对非小细胞肺癌细胞增殖、克隆等生物学特性的影响，为寻找有效的靶基因治疗非小细胞肺癌提供思路。

1 材料与方法

1.1主要材料 聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific；胎牛血清购自美国Gibco；引物由上海英骏公司合成；细胞周期蛋白(Cyclin)D1抗体、p21抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体均购自美国Abcam；shRNA-ZNF217慢病毒干扰载体由汉恒生物技术(上海)有限公司构建；cDNA合成试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；SYBR Green Real-time PCR试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司。

1.2细胞株 人非小细胞肺癌细胞A549、H1299、SW1573和正常人肺上皮细胞BEAS-2B均培养于含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青链霉素的RPMI1640培养液中，细胞均置于37℃，体积分数为5% CO2培养箱内培养，细胞培养3 d以后，显微镜下观察细胞汇合度为90%左右，用0.25%的胰蛋白酶消化传代。人非小细胞肺癌细胞A549、H1299、SW1573和正常人肺上皮细胞BEAS-2B均购自美国ATCC。

1.3Realtime PCR检测ZNF217在非小细胞肺癌细胞中的表达 人非小细胞肺癌细胞A549、H1299、SW1573和正常人肺上皮细胞BEAS-2B经0.25%的胰蛋白酶消化以后，添加TRIZOL裂解液，置于冰上充分裂解以后，添加200 μl的氯仿，剧烈震荡以后，置于室温中孵育3 min，12 000 r/min离心10 min后，吸取上层水相至离心管中，添加500 μl的异丙醇溶液混合后将RNA沉淀，用75%乙醇溶液洗涤RNA后，晾干，用DEPC水溶解后，保存在-80℃。用逆转录试剂盒合成cDNA，用SYBR Green Real-time PCR试剂盒检测ZNF217水平。ZNF217正向引物5'-AAACATGCCAACTCAATCCCTC-3'，反向引物5'-GGAATGGAACAACAGCGGT-3'。β-actin正向引物5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反向引物5'-GCTCTCACCTTCACCGTTCC-3'。

1.4Western印迹测定ZNF217在非小细胞肺癌细胞中的表达 取人非小细胞肺癌细胞A549、H1299、SW1573和正常人肺上皮细胞BEAS-2B，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，将PBS吸净，添加适量的裂解液，放在冰上裂解30 min以后，14 000 r/min，4℃离心10 min。以BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。常规方法配制5%的浓缩胶和10%的分离胶，在电泳装置中加入电泳液，上样孔中加入30 μg蛋白样品，80 V的电压电泳，等到蛋白在积层胶中成为一条直线以后，改为100 V电压继续电泳。观察染料进入凝胶下端的1 cm处时，结束电泳。把凝胶上的蛋白在4℃环境中转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜经过5%牛血清白蛋白封闭(室温封闭60 min)后，再与一抗和二抗孵育。一抗稀释倍数为1∶800，二抗稀释倍数为1∶1 000。按照ECL显色试剂盒显色以后，用凝胶成像分析仪采集图片以后，分析各条带灰度值。ZNF217蛋白表达水平=ZNF217蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.5细胞分组 慢病毒感染：H1299细胞密度为40%时，将上清吸除，添加病毒液，病毒感染复数为20，培养12 h以后，把病毒液弃掉，加入细胞培养液继续培养3 d，荧光显微镜下观察感染效率高于85%，用嘌呤霉素筛选抗性细胞用于后续实验研究。感染shRNA-ZNF217慢病毒干扰载体的细胞计为干扰组，同时将感染对照慢病毒载体的细胞作为阴性对照组，把没有感染的细胞作为空白对照组。

1.6MTT测定细胞增殖 空白对照组、阴性对照组、干扰组细胞按照96孔板每孔添加100 μl细胞悬液接种，每个孔内加入4 000个细胞，在培养48 h以后，在每个孔内加入20 μl的MTT工作液，继续放在37℃中孵育4 h。把孔内的液体吸弃，在每个孔内加入150 μl的二甲基亚砜，观察结晶物溶解以后，检测490 nm的OD值，经空白孔调零以后，计算细胞增殖率变化，空白对照组增殖率为100%。

1.7平板克隆实验检测细胞克隆能力 空白对照组、阴性对照组、干扰组细胞以0.25%的胰蛋白酶消化以后，用细胞培养液将细胞密度调整为1 000个细胞/ml，接种到6孔细胞培养板内，培养约10 d后，以甲醇溶液固定以后，用0.25%的结晶紫染色，观察细胞数目大于50的克隆数目，以克隆数目占接种细胞数目的百分比表示克隆形成率。

1.8流式细胞术检测细胞周期 空白对照组、阴性对照组、干扰组细胞以0.25%胰蛋白酶消化以后，用75%的乙醇溶液将细胞悬浮以后，放在4℃结合1 h，1 000 r/min离心10 min，把上清溶液弃掉，添加PBS将细胞重悬。再添加50 μg/ml的碘化丙啶(PI)染液300 μl，于4℃避光染色30 min。流式细胞仪测定细胞周期的变化情况。

1.9流式细胞术检测细胞凋亡 空白对照组、阴性对照组、干扰组细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，收集细胞，添加200 μl结合缓冲液把细胞悬浮以后，再添加PI和Annexin V-FITC，加入200 μl的缓冲液，立即用流式细胞仪检测细胞凋亡变化。

1.10Western印迹检测p21、Cyclin D1、Bax蛋白表达 空白对照组、阴性对照组、干扰组细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，收集细胞，用Western印迹方法检测细胞中p21、Cyclin D1、Bax蛋白水平，步骤同1.4。p21抗体以1∶600稀释，Cyclin D1抗体以1∶800稀释，Bax抗体以1∶400稀释。

1.11统计分析 经SPSS21.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1ZNF217在人非小细胞肺癌细胞中高表达 人非小细胞肺癌细胞A549、H1299、SW1573和正常人肺上皮细胞BEAS-2B中ZNF217 mRNA和蛋白水平明显高于正常人肺上皮细胞BEAS-2B(P<0.05)。并且H1299细胞中ZNF217 mRNA和蛋白水平明显高于A549和SW1573细胞(均P<0.05)。选用H1299继续做后续实验，见图1和表1。

2.2shRNA-ZNF217下调非小细胞肺癌细胞中ZNF217的表达水平 shRNA-ZNF217慢病毒干扰载体感染后的H1299细胞中ZNF217 mRNA和蛋白水平明显降低(P<0.05)，见图2和表2。shRNA-ZNF217慢病毒干扰载体下调H1299细胞中ZNF217 的表达。

1～4：BEAS-2B细胞，SW1573细胞，H1299细胞，A549细胞图1 Western印迹检测人非小细胞肺癌细胞和正常肺上皮细胞中ZNF217蛋白水平

细胞ZNF217 mRNAZNF217 蛋白BEAS-2B1.00±0.000.15±0.02SW15731.68±0.121)0.24±0.051)H12992.85±0.171)2)3)0.42±0.031)2)3)A5492.14±0.131)2)0.35±0.031)2)

与BEAS-2B比较:1)P<0.05；与SW1573比较:2)P<0.05；与A549比较:3)P<0.05

图2 Western印迹检测慢病毒感染后细胞中ZNF217表达水平

组别ZNF217 mRNAZNF217 蛋白空白对照组1.00±0.000.40±0.06阴性对照组0.99±0.130.41±0.04干扰组0.43±0.031)0.19±0.031)

与空白对照组和阴性对照组比较：1)P<0.05，下表同

2.3ZNF217沉默降低非小细胞肺癌细胞增殖和克隆能力 沉默ZNF217后的非小细胞肺癌细胞的增殖率和克隆形成率均明显低于空白对照组和阴性对照(均P<0.05)，见表3。沉默ZNF217降低非小细胞肺癌细胞增殖和克隆形成能力。

表3 沉默ZNF217后细胞增殖率和克隆形成率

2.4ZNF217沉默对非小细胞肺癌细胞周期的影响 沉默ZNF217后的非小细胞肺癌细胞G1比例明显升高，S期比例明显降低，同时细胞中周期蛋白Cyclin D1表达水平明显降低，p21表达水平明显升高，见图3和表4。沉默ZNF217将非小细胞肺癌细胞阻滞在G1期，阻碍细胞从G1期向S期过渡。

图3 Western印迹检测沉默ZNF217后的非小细胞肺癌细胞中p21、Cyclin D1蛋白水平

组别G1(%) S(%)G2/M(%)Cyclin D1p21空白对照组56.23±4.1221.45±2.1722.32±1.740.82±0.090.36±0.08阴性对照组54.71±6.3822.92±2.5822.37±2.560.80±0.060.38±0.05干扰组71.23±7.211)8.25±1.051)20.52±2.450.35±0.031)0.76±0.081)

2.5ZNF217沉默促进非小细胞肺癌细胞凋亡 沉默ZNF217后的非小细胞肺癌细胞凋亡率明显升高，细胞中凋亡蛋白Bax水平也明显升高，见图4和表5。沉默ZNF217诱导非小细胞肺癌细胞凋亡。

图4 Western印迹检测非小细胞肺癌细胞中凋亡蛋白Bax表达变化

组别凋亡率(%)Bax空白对照组2.25±0.230.28±0.03阴性对照组2.98±0.310.27±0.06干扰组18.56±1.471)0.74±0.061)

3 讨 论

ZNF217存在于多种肿瘤基因复制活跃的20q13.2染色体上，其蛋白的N端含有2簇7个经典的锌指结构，其中1簇中的第6和第7个锌指结构能够特异性的同DNA双链结合，另外，ZNF217还能够与组蛋白修饰蛋白、共受体蛋白等结合，参与调控转录受体复合物的形成〔8,9〕。ZNF217是一个潜在的癌基因，能够调控多种肿瘤细胞生物学特性，其在乳腺癌、肝癌、胶质瘤等肿瘤中表达上调〔7,8,10〕。目前在胶质瘤、卵巢癌等细胞中均已发现，沉默ZNF217具有抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡的作用〔11～13〕。ZNF217在非小细胞肺癌组织中的表达水平远远高于对应的癌旁组织，并且其表达水平的高低与肿瘤患者生存率负相关〔5〕。本实验结果表明，ZNF217在3株非小细胞肺癌细胞中的表达水平均高于正常肺上皮细胞，提示ZNF217在非小细胞肺癌中高表达。肿瘤细胞的恶性增殖与肿瘤细胞周期进展密切相关，其中G1期向S期进展是细胞周期中的重要检查点，需要多种因子的共同调控作用〔14,15〕。Cyclins蛋白家族在特定的细胞周期被激活，其中Cyclin D1作为Cyclins家族的成员之一可以促进细胞从G1期进入S期，其在G1期表达水平上调〔16〕。细胞周期蛋白活性的高低与细胞中周期抑制因子的表达水平有关，其中p21能够抑制G1期Cyclin D1的活性，阻碍细胞从G1期向S期进展〔17～19〕。之前的研究显示，ZNF217可以促进肝癌细胞从G1期向S期进展，从而发挥促进肝癌细胞生长的作用〔7〕。本实验的结果显示，沉默ZNF217后的肝癌细胞发生G1期阻滞，同时细胞中Cyclin D1蛋白水平降低，p21蛋白水平升高，说明沉默ZNF217可以通过调控细胞周期相关因子阻滞非小细胞肺癌细胞周期，从而发挥细胞增殖抑制的作用。

癌细胞恶性增殖的同时常常伴随有细胞凋亡异常减少等现象，细胞凋亡同细胞死亡不同，是受到细胞内多种基因调控的结果〔20～22〕。Bax是细胞凋亡促进因子，其属于Bcl-2蛋白家族的成员，在细胞凋亡发生时高表达，Bax也是细胞凋亡发生的标志蛋白〔23～25〕。研究显示，沉默ZNF217诱导胶质瘤等肿瘤细胞凋亡的同时促进细胞中Bax的表达〔11〕。本实验的结果显示，沉默ZNF217后非小细胞肺癌细胞中Bax的蛋白水平升高，同时细胞凋亡率也升高，提示沉默ZNF217可以诱导非小细胞肺癌细胞凋亡。以上表明，ZNF217作为一种癌基因，在非小细胞肺癌细胞中高表达，沉默其表达可以通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期，发挥抑非小细胞肺癌细胞生长的作用，靶向ZNF217可能是治疗非小细胞肺癌的途径之一，ZNF217在肿瘤发生中的机制尚不明确，在以后的实验中会对其作用机制进行深入探讨。