丁高明，峗淑莉，张景涛

(广东医科大学附属中山医院肿瘤血液科，广东 中山 528415)

临床中针对地中海贫血的治疗通常采用输血的方式，反复输血加上患者自身溶血异常极易导致机体内铁负荷过重，对患者的病情不利，但临床中对于哪种基因类型的地中海贫血更容易发生铁负荷过重的重视度不高[1]。鉴于此，笔者对150例地中海贫血患者进行基因与铁指标的检测，对比分析不同基因类型地中海贫血患者的铁负荷水平，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年2月至2018年2月广东医科大学附属中山医院收治的地中海贫血患者150例，其中男性86例、女性64例；年龄18～37岁、平均(22.34±4.63)岁；病程1～13年、平均(6.64±1.34)年；Hb 59～118 g·L-1，RBC 3.2～6.0×1012L-1，Ret 2.4%～14.5%，血红蛋白H(HbH)7.2%～24.6%，血红蛋白F(HbF)10.3%～18.5%；患者症状体征：面色苍黄84例、巩膜黄染9例、地中海面容63例、生长发育迟缓90例、肝肿大90例、脾肿大62例、心尖收缩期杂音53例、合并感染135例。

1.2 纳入标准

所有患者经临床诊断及生化检验证实符合地中海贫血诊断标准，血红蛋白质量浓度均>100 g·L-1，红细胞平均体积(MCV)<79 fL，红细胞平均血红蛋白量(MCH)<27 pg，红细胞渗透脆性下降。

1.3 检测方法

于患者清晨空腹状态下取其静脉血5 mL，并加肝素抗凝待用。采用微阵列杂交技术进行基因诊断，以抗硷试验测定HbF，操作方法如下：1)取0.083 mol·L-1KOH 1.6 mL加于试管中，置25 ℃ 水浴；2)待5～10 min后加0.1 mL血红蛋白溶液，立即开动秒表，用吸管洗6次,轻轻摇动试管10 s，此步操作需在20 s内完成；3)准确计时60 s后，加入酸性硫酸铵液3 mL，立即颠倒混匀6次；4)用滤纸过滤，取滤液在540 nm波长下比色，以蒸馏水作空白，读取抗碱血红蛋白的吸光度；5)另取血红蛋白溶液0.02 mL，加入5 mL水中，混匀，按上述方法比色，读出总Hb的吸光度；6)计算结果。以醋酸纤维薄膜电泳法测定HbA2，操作方法如下：1)裁剪适量尺寸滤纸条来搭建滤纸桥，再将缓冲液倒入电泳槽，在醋酸纤维素薄膜无光泽面做好点样标记；2)将该面在下浸入缓冲液约20 min，在浸透完全以后，取出吸取多余缓冲液备用；3)用加样器取适量蛋白样品均匀加于点样线处，最终形成一定宽度、粗细均匀的直线；4)将点样端位于负极，无光泽面朝下，平整放于滤纸桥上，平衡完毕后，调节电压并开始电泳；5)电泳完毕后，小心取下薄膜，浸入染色液2 min，取出后在漂洗液中反复漂洗，直到干净为止，然后观察电泳结果；6)要注意醋酸纤维薄膜吸水性差，电泳的过程中水分容易蒸发而使电泳终止，因此电泳过程应在密闭电泳槽中进行，以确保处于湿润状态。以血液锌原卟啉测定代替红细胞游离原卟啉测定，血液锌原卟啉测定仪由广东康达发展公司生产，试验方法为：以市售标准XC盖玻片经盐酸酒精浸泡擦干备用，取患者耳垂血，并置于盖玻片中央部，以细玻璃棒摊匀成一直径约0.8 cm的血膜，进行ZPP结果测定，单位pmol·L-1(全血)。采用放射免疫法对血清铁蛋白(SF)检测，试剂盒由北京原子能研究所提供。采用α-α双联吡啶法测定血清铁(SI)、铁结合力(TIBC)及铁饱和度(TS)，制备方法如下：1)取70 g无水吡啶与13 g无水三氯化铁混合,在封管中于300 ℃加热反应约35 h；2)冷却后,反应物固化为红黑色结晶,打开封管,用少量热水洗出固体物的红黑色溶液；3)用乙醚萃取除去油状不纯物，用碳酸氢钠中和后,用蒸汽加热除去过量的吡啶；4)然后将混合物调成强碱性,用蒸汽蒸出2,2′-联吡啶；蒸出物酸化后蒸发浓缩,再加氢氧化钠,用乙醚提取,除去乙醚得粗品，粗品用乙醇来重结晶、活性炭脱色即得纯品,以酸性亚铁氰化钾对骨髓细胞涂片进行染色。

1.4 观察指标与判定标准

对不同基因型地中海贫血患者的铁负荷水平及铁缺乏水平进行对比观察，铁缺乏判断标准为：1)血清铁蛋白<12 μg·L-1；2)骨髓染色显示骨髓小粒可染铁消失、铁粒幼细胞<0.15；3)转铁蛋白饱和度<0.15；4)FEP/Hb>4.5 mg·g-1[2]。铁负荷过重判定标准为：1)SF>200 μg·L-1；2)SI>27 μmol·L-1；3)TS>30%；4)骨髓细胞涂片细胞外铁增加幅度在—之间[3]。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 地中海贫血患者基因类型

150例地中海贫血患者基因类型如表1所示。

表1 地中海贫血基因类型

2.2 α地中海贫血与β地中海贫血患者铁负荷情况

本次研究150例地中海贫血患者中37例(24.67%)合并铁缺乏，33例(22.00%)铁负荷过重，β地中海贫血患者铁负荷过重人数虽多于α地中海贫血患者，但二者所占比例差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同基因类型贫血患者铁负荷情况对比

2.3 各基因型地中海贫血的铁负荷情况

150例地中海贫血患者中，纯合子β地中海贫血患者最容易发生铁负荷过重，静止型α地中海贫血患者未发生铁负荷过重情况；静止型α地中海贫血患者最容易合并铁缺乏，纯合子β地中海贫血基因型患者均未发生铁缺乏现象。详情见表3。

表3 各基因型地中海贫血的铁负荷情况

3 讨论

地中海贫血是一组遗传性溶血性贫血疾病，由遗传基因缺陷致使血红蛋白中一种或一种以上珠蛋白链合成缺如或不足所导致，缘于基因缺陷的复杂性与多样性，使缺乏的珠蛋白链类型、数量及临床症状变异性较大，广泛分布于世界许多地区[4]。临床中针对地中海贫血的命名与分类主要是以机体所缺乏的蛋白链种类及缺乏程度为依据，分为α型、β型、δβ型和δ型4种，其中以β和α地中海贫血较为常见，α地中海贫血是由于α珠蛋白基因缺失造成，少数也可由基因点突变导致[5]；β地中海贫血发生的分子病理复杂，已知有100种以上的β基因突变，以基因的点突变为主，少数为基因缺失[6]。这些基因的缺失或点突变可造成各种肽链的合成速率不同，致使血红蛋白的组分改变，过剩的α链或β链沉积于幼红细胞和红细胞中，形成包涵体附着于红细胞膜上而使其变僵硬，在骨髓内大多被破坏而导致“无效造血”。部分含有包涵体的红细胞虽能成熟并被释放至外周血，但当它们通过微循环时容易被破坏；从而出现血清铁负荷过重[7]。

本次研究对150例地中海贫血患者进行分析，结果发现37例(24.67%)合并铁缺乏，33例(22.00%)铁负荷过重，13例静止型α地中海贫血患者未发生铁负荷过重情况，但均合并铁缺乏现象，出现该情况的原因是不合并缺铁或溶血患者其血色素多在正常范围未被纳入。本次研究侧面也提示：如果静止型α地中海贫血出现与贫血程度不相符合的情况应考虑合并缺铁情况，补铁治疗是一种有效方法。在95例HbH病中7例非缺失型并发铁负荷过重，明显高于缺失型(1例)；而合并铁缺乏患者中缺失型HbH基因型(3例)则多于非缺失型(2例)，这表明非缺失型HbH病较易发生铁负荷过重，这主要是由于非缺失型HbH病的血红蛋白更易形成β四聚体，该四聚体极不稳定，容易合并溶血，因此临床症状重，输血次数增多，反过来又抑制骨髓造血，更加重血清铁负荷。在本次研究中，β地中海贫血患者合并铁缺乏15例(40.54%)，均为杂合子β地中海贫血基因型，纯合子β地中海贫血基因型无铁缺乏现象发生；合并铁负荷过重19例(57.58%)，其中杂合子β地中海贫血基因型仅有1例，这表明杂合子β地中海贫血基因型较易发生铁缺乏，这主要是由于缺失型HbH病、杂合子β地中海贫血基因型相对症状稍轻，输血次数也少，当遇到引起患者地中海贫血的原因时，即可能发生铁缺乏。

综上所述，地中海贫血患者的基因类型与其铁负荷情况相关，但并不完全对应，临床中应根据地中海贫血患者的不同基因型结合患者铁负荷水平进行相应处理，以改善患者的临床症状。