林玫，甄海宁，何芳，丁敏，陈亚隽，袁竹青，薛欣欣，鲍敏

[武汉大学附属同仁医院（武汉市第三医院） 呼吸内科，湖北 武汉 430060]

目前抑制核转录因子-κB（nuclear factor, NFκB）的活性已成为治疗哮喘气道炎症的新靶点。醛糖还原酶（aldose reductase, AR）受到环境中的炎症刺激后，表达明显升高，继而转录因子NF-κB被激活，其下游炎症介质释放，促进炎症的病理过程[1]。醛糖还原酶抑制剂（aldose reductase inhibitors, ARI）可以阻断依赖NF-κB的炎症信号，提示ARI对炎症反应有调控作用[2]。但屋尘螨诱导气道炎症的影响研究甚少。为此，笔者拟探讨ARI对屋尘螨诱导的气道上皮细胞炎症因子的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器Hettich UNIVERSAL 32R台式离心机（德国Eppendorf公司），微量加样器、微量加样管均购自德国Eppendorf公司，垂直流超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司），恒温二氧化碳培养箱（上海姚氏仪器设备厂），热循环仪（德国Eppendorf公司），酶标仪（德国Satorius公司），Nandrop分光光度计（德国Eppendorf公司），恒温摇床（美国New Brunswich Scientific公司），蛋白电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

1.1.2 主要试剂健康人支气管上皮细胞16-HBE（武汉大风生物科技有限公司），RPMI 1640培养液（美国Invitrogen公司）、胎牛血清（美国Invitrogen公司），屋尘螨抗原（Horsholm，Denmark，丹麦ALK公司），焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）（广州索沃生物技术公司），RNA提取试剂盒（日本TaKaRa公司），逆转录酶（M-MLV-RT）、引物均购自上海英骏生物工程有限公司，PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），ELISA试剂盒（武汉谷歌生物科技有限公司），核蛋白提取试剂盒（南京凯基生物科技有限公司），醛糖还原酶抑制剂唑泊司他（Zopolrestat）（美国Pfizer 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将复苏后的16-HBE细胞置于25 cm2培养瓶中，用含12%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，置培养瓶于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中，每日更换培养液。倒置显微镜下可见细胞呈不规则多边形，待90%培养瓶底被细胞呈鹅卵石样铺满后，进行传代培养。换液1次/d，约2 d后传代。按l∶2～1∶4的比例将其分瓶传代培养。当细胞融合至90%～95%后，将细胞消化，并用细胞计数板计数，传至6孔平底细胞培养板，每孔加入密度为2×105个/ml的细胞悬液2 ml，继续培养24 h后，建立细胞模型及相关实验。

1.2.2 细胞分组培养板中的细胞分为空白对照组、屋尘螨组、屋尘螨+Zopol组和Zopol组，每组分别置于12个培养孔中培养。选择既不影响细胞活性，也有显著抑制效应的浓度，屋尘螨+Zopol组以50μmol/L 的浓度加入Zopol，并加入屋尘螨共同培养24 h；Zopol组以50μmol/L的浓度加入Zopol，但不加入屋尘螨；空白对照组不加入刺激物，培养24 h。屋尘螨组加入屋尘螨刺激，培养24 h。

1.2.3 提取核蛋白收集细胞，弃掉培养液，以预冷的磷酸盐缓冲溶液洗涤2遍；用移液枪吸去上清液；每毫升Buffer A中加入5μl 100 mmol/L PMSF、1μl蛋白酶抑制剂、1μl二硫苏糖醇，根据细胞压积，按体积比行细胞压积∶Buffer A为1.0∶1.5，加入上述准备好的预冷的150μl Buffer A，以最大转速进行涡旋剧烈振荡15 s，并置于冰上10 min；加入12.5μl Buffer B，快速震荡混匀，放置冰上1 min后，于4℃、16 000 r/min离心30 s。收集上清至新的离心管。于每毫升Buffer C中加入1μl蛋白酶抑制剂、5μl 100 mmol/L PMSF、1μl二硫苏糖醇，在离心沉淀物中加入上述准备好的预冷的100μl Buffer C，以最大转速进行涡旋剧烈振荡15 s，并置于冰上30 min，每间隔10 min进行涡旋剧烈振荡15 s；4℃、16 000 r/min离心10 min，把上清转入预冷的离心管；以考马斯亮蓝G-250染料，进行蛋白浓度测定，并保存于-80℃，应避免反复冻融。

1.2.4 Western blotting取出聚丙烯酰胺凝胶电泳，装入电泳槽，再加入电泳缓冲液；将蛋白样品与5×十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶加样缓冲液相混合，再按照上样顺序进行点样，使样本浓度及体积保持一致；对应正负极盖上盖子，红对红，黑对黑，将电压调整至80 V，进行电泳；气泡出现指示电泳开始，待蛋白样品电泳至下层分离胶时暂停电泳，将电压调至120 V继续电泳；等溴酚蓝电泳到分离胶底部时，停止电泳。将裁剪掉右上角的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride, PVDF）泡入甲醇中待用；在容器中倒入预冷的转膜缓冲液，将转膜夹和海绵完全浸入转膜缓冲液中，并将滤纸和用甲醇活化的PVDF膜一起放入转膜液中10 min；取出电泳完的凝胶玻璃板，切割目的蛋白所在区域凝胶；将目的蛋白凝胶置于滤纸上，并用转膜液润湿，将PVDF膜置于凝胶之上，赶出气泡，盖上滤纸，防止引入气泡；合上转膜夹，将转膜夹对应正负极放入转膜槽，电极方向为膜正胶负，使夹的黑面对着槽的黑面，且夹的白面对着槽的红面；放入冰盒，灌满转膜液，对应正负极盖上盖子，于200 mA进行转膜60 min。在室温下将PVDF膜正面朝上放入含5%脱脂奶粉的TBST封闭液，摇床上封闭孵育1 h；把一抗（兔抗小鼠NF-κB/p65多克隆抗体，兔抗小鼠Histone H3抗体）以含0.5%脱脂奶粉的TBST抗体稀释液按1∶1 000稀释；取出膜并放于已经加好一抗的小塑料袋中；室温下把膜置于摇床上一抗孵育1 h；取出膜，TBST溶液中洗涤，每次10 min，重复漂洗3次。用抗体稀释液以1∶6 000稀释二抗（辣根过氧化物酶标记羊抗兔免疫球蛋白G）， 把膜移到已经加好二抗溶液的小塑料袋中，于室温、摇床上二抗孵育1 h；取出膜并用TBST溶液洗涤 3次，每次10 min。经过显影、定影，将图像输入电脑，应用图像分析软件对Western blotting检测结果进行分析，以Histone H3蛋白作为对照，各组中NF-κB/p65蛋白的面积灰度值与Histone H3蛋白的比值即表达 强度。

1.2.5 提取细胞总RNA吸去各6孔板中的细胞培养液，然后在每孔中加入1 ml Trizol，室温放置5 min，使其充分裂解，收集至去RNA酶的1.5 ml EP管中；12 000 r/min离心5 min，弃去沉淀；加入氯仿0.2 ml，震荡15 s，静置于室温15 min；4℃、12 000 r/min离心15 min；将上层水相转至另一EP管中，加入异丙醇0.5 ml，颠倒混匀，室温下静置10 min；于4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清，RNA沉淀沉于管底；加入75%乙醇lml（用0.1% DEPC水配置），震荡混匀；4℃、8 000r/min离心5 min，弃上清，于室温下自然风干RNA沉淀5～10 min，不要让RNA过度干燥；加DEPC水40μl，置60℃水浴箱5 min，使RNA溶解。在Nandrop分光光度计上测定RNA浓度和 纯度。

1.2.6 逆转录将RNA模板、引物、dNTPmix、RNA酶抑制剂、M-MLV逆转录酶、RT Buffer及RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。根据以下配比配制反应体系：dNTPmix 4μl、Primer 2μl、RNA模板2μg、5×RT Buffer 4μl、RNA酶抑制剂2μl、M-MLV逆转录酶1μl及RNase-Free Water补充反应体积至20μl。涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。42℃孵育50 min，72℃孵育5 min，反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却，置于-20℃条件下保存。

1.2.7 实时荧光定量PCRPCR反应体系：2×Ultra SYBR Mixture（TaqDNA聚合酶和dNTPs）10μl，正向引物（10μmol/L）0.4μl，反向引物（10μmol/L）0.4μl，DNA模板0.8μl，RNase-Free Water 8.4μl，总体积20μl。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，后2步重复40个循环；熔解曲线分析程序：95℃ 15 s，61℃ 55 s，95℃ 15 s。NF-κB/p65正向引物：5’-ATGTGGAGATCATTGAGCAGC-3’，反向引物：5'-CCTGGTCCTGTGTAGCCATT-3'。反应结束后用熔解曲线分析PCR产物的特异性，排除引物二聚体的存在。将目的基因Ct值用GAPDH的Ct值标准化，用2-△△Ct表示基因表达的相对量。△△Ct=（Ct目的基因-Ct内参基因）实验组-（Ct目的基因一Ct内参基因）对照组。为进一步观察产物的表达情况，将PCR产物进行琼脂糖凝胶 电泳。

1.2.8 酶联免疫吸附试验（enzyme-1inked immunosorbent assay, ELISA）以ELISA检测细胞上清液中IL-29、IL-6的浓度。配制好不同浓度IL-29/IL-6的标准品，加50μl待测的细胞上清液或标准品于酶标板上，每孔加入50μl抗IL-29/IL-6抗体，使之震荡混匀；酶标板于37℃孵育2 h；洗涤4次；每孔加入100μl酶标试剂，于室温孵育30 min；洗涤4次；每孔加入100μl底物显色液，于室温下，避光孵育30 min后显色；加入100μl终止反应液，将反应板置于多功能酶标仪中，测定各孔于450 nm波长处的光密度值，并计算其浓度。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P ＜0.05为差异有统计学 意义。

2 结果

2.1 各组NF-κB/p65 mRNA相对表达量比较

各组NF-κB/p65 mRNA相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F =160.580，P =0.000）；屋尘螨+Zopol组低于屋尘螨组（P ＜0.05），但高于空白对照组（P ＜0.05），Zopol组与空白对照组NFκB/p65 mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1和图1。

2.2 各组NF-κB/p65蛋白相对表达量比较

各组NF-κB/p65蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F =229.181，P =0.000）；屋尘螨+Zopol组低于屋尘螨组（P ＜0.05），但高于空白对照组（P ＜0.05），Zopol组与空白对照组NF-κB/p65蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1和图2。

图1 各组细胞NF-κB/p65 mRNA相对表达量比较

表1 各组细胞NF-κB/p65相对表达量比较 （n =12，±s）

表1 各组细胞NF-κB/p65相对表达量比较 （n =12，±s）

组别NF-κB/p65 mRNANF-κB/p65蛋白空白对照组1.110±0.2110.271±0.043屋尘螨组3.243±0.3821.125±0.145屋尘螨+Zopol组2.016±0.258 0.658±0.098 Zopol组1.105±0.218 0.265±0.042

图2 各组细胞NF-κB/p65核蛋白相对表达量比较

2.3 各组IL-6、IL-29蛋白水平比较

各组细胞上清液的IL-6、IL-29蛋白水平的比较，经方差分析，差异有统计学意义（F =169.729和118.681，均P =0.000）；屋尘螨+Zopol组低于屋尘螨组（P ＜0.05），但高于空白对照组（P ＜0.05），Zopol组与空白对照组IL-6蛋白水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2和 图3。

表2 各组IL-6、IL-29蛋白水平比较 （n =12，pg/ml，±s）

表2 各组IL-6、IL-29蛋白水平比较 （n =12，pg/ml，±s）

组别IL-6IL-29空白对照组103.916±15.85955.083±13.534屋尘螨组300.000 ±37.033158.833±20.630屋尘螨+Zopol组201.000±25.193103.475±12.409 Zopol组102.791±15.66454.166±15.278

图3 各组细胞上清液IL-6、IL-29蛋白水平比较 （±s）

3 讨论

有研究发现ARI可抑制细胞因子、生长因子、高血糖、LPS诱导的细胞毒信号及炎症标志物的表 达[3-4]。ARI可抑制某些过敏原诱导的小鼠哮喘模型的气道炎症，进一步肯定了ARI的抗炎作用。AR基因敲除的大鼠可耐受变应原，在很大程度上减轻了变应原诱导的肺部炎症改变[5]。丙烯醛是一种重要的内源性脂质过氧化产物。有研究结果表明，ARI可以抑制丙烯醛诱导的肺泡上皮细胞的细胞毒性[6]。

有研究发现，ARI可阻止心瓣膜术后再狭窄、糖尿病并发症及动物模型动脉硬化的发生[7-8]。还有研究显示，ARI通过防止DOX诱导的内皮细胞毒性和功能障碍，避免了与蒽环类化疗相关的心脏毒性[9]。AR还参与多种炎症疾病的病理过程，因此ARI也可能作为抗炎药物而得到发展。

过去的研究显示，在某些动物和细胞模型中，ARI可以调控NF-κB介导的炎症信号；并观察到AR药物抑制剂或基因敲除，防止了小气道上皮细胞的凋亡及活性氧的增殖、炎症标志物的分泌、NF-κB的激活[10]。有研究提示依赖ARI的NF-κB的失活，减少了一些炎症基因的转录和表达[11]。AR可以介导过敏原诱导的气道重塑。AR抑制剂非达司他可以通过抑制TGFβ1诱导的Smad非依赖性和PI3K/AKT/GSK3β依赖性途径，而阻断这个气道重塑过程[12]。

本实验结果显示，屋尘螨+Zopol组经屋尘螨及ARI唑泊司他共同作用24 h后，人支气管上皮细胞的NF-κB/p65 mRNA水平、NF-κB/p65蛋白水平、IL-6及IL-29蛋白水平均低于屋尘螨组。ARI唑泊司他可降低人支气管上皮细胞NF-κB/p65的表达，并可能通过抑制NF-κB介导的炎症信号通路，而减少炎症因子IL-6和IL-29的表达。

有研究显示，ARI明显地减轻了气道高反应性、免疫球蛋白E的水平，嗜酸性细胞的浸润，以及气道Th2细胞因子的释放[13-14]，另外，也有实验显示，经卵清蛋白刺激的小鼠，其气道炎症细胞的迁移及炎症细胞因子、趋化因子、杯状细胞化生、胶原沉积及气道高反应性可以被ARI抑制，提示ARI可能提供一个新的治疗途径应对哮喘这类气道炎症疾病。ARI非达司他处理的小鼠，接触过敏原后如鼻划痕，肥大细胞脱颗粒，在鼻通道释放类胰蛋白酶等的早期反应，与对照组比较，明显减弱，且后期反应如炎症细胞浸润、Th2型细胞因子的释放、鼻上皮重塑等均明显减弱，提示了ARI对过敏性鼻炎的疗效[15]。

综上所述，唑泊司他调控了屋尘螨诱导的NF-κB介导的炎症信号，明显地抑制了气道上皮NF-κB的表达及其下游炎症因子的表达，深入研究ARI，可能为屋尘螨引起的气道炎症的治疗提供新的方向。