林昶，李玉平，齐建彤，郑曙光，朱璨，柴艺汇，徐昌君，王和生，杨长福

（贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002）

何首乌为蓼科植物何首乌的干燥块根，作为中医常用的一味传统中药，在我国有着悠久的应用历史。现代研究表明，何首乌具有抗动脉粥样硬化的作用[1]。该药主要含3类有效成分：蒽醌类、二苯乙烯苷类及多糖类化合物。其中二苯乙烯苷有降血脂和抗动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）的作用，但其作用机制还不清楚[2-4]。本实验以肝癌HepG2细胞作为研究对象，采用氧化性低密度脂蛋白（oxidation low density lipoprotein, ox-LDL）制作高胆固醇细胞模型，二苯乙烯苷干预后观察胆固醇含量的变化，以及ATP结合盒转运蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1）、ATP结合盒转运蛋白G1（ATP-binding cassette transporterG1, ABCG1）和B族I型清道夫受体（Scavenger reptor class B type I, SR-BI）mRNA表达水平的变化，初步探索二苯乙烯苷降胆固醇的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肝癌HepG2细胞（上海陆奥生物科技有限公司），0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司），青链霉素混合液（哈尔滨哈药集团制药总厂），高糖DMEM（美国HyClone公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），总RNA提取试剂盒（日本TaKaRa公司MiniBEST Universal RNA Extraction Kit），cDNA链合成试剂盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser）、PCR酶（Premix TaqTM）、琼脂糖及DNA Marker等购自宝生物工程（大连）有限公司，ox-LDL（北京索莱宝科技有限公司），胆固醇含量测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司），DL5和00 DNA Marker（北京康为世纪生物科技有限公司），油红O染液（北京索莱宝科技有限公司），生工生物工程（上海）股份有限公司合成逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）扩增引物。见表1。

1.2 仪器与设备

MSL-3020型全自动高压灭菌锅（日本三洋有限公司），BSC 1800-Ⅱ-A/B3型超净工作台（上海瑞仰净化装备有限公司），TS-100F型倒置相差显微镜（日本Nikon公司），Multiskan FC自动酶标读仪（美国Thermo公司），NKSY恒温水浴锅（江苏诺基仪器有限公司），二氧化碳培养箱（美国Thermo公司），微量加样器（德国Eppendorf公司），D-37520台式冷冻高速离心机（美国Thermo Fisher公司），JA2004N型电子天平（上海箐海仪器有限责任公司），SIM-F140AY6ICEMAKER型制冰机（日本三洋有限公司），ELIX/RIOS-20型反渗透纯水系统（法国Millipore公司），总/游离胆固醇含量测定试剂盒（E1015/E1016）（苏州科铭生物技术有限公司），PCR扩增仪（GeneAmp 9700型，美国ABI公司），凝胶图像分析系统（GGM/D2，英国Syngene公司），超低温冰箱（德国Eppendorf公司），Bio-Rad GEL DOC 2000凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司），细胞培养瓶（美国Corning公司），6孔和96孔培养板（美国 Corning公司）。

表1 PT-PCR引物序列

1.3 方法

1.3.1 细胞培养HepG2细胞常规培养于链霉素和青霉素终浓度为100 u/ml的含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，每2～3天细胞传代1次。取对数生长期的细胞用于实验研究。

取HepG2细胞悬液，在显微镜下进行细胞计数，调整细胞浓度为5×106个/ml，将细胞悬液接种于25 cm2培养瓶内，1ml/瓶，用培养基补足至3.5 ml，在37℃、5%二氧化碳CO2环境下孵育24 h至细胞贴壁，弃培养基，用提前预冷的PBS冲洗2次，更换培养液。实验分为正常组、模型组（ox-LDL 50 mg/L）、 A组（ox-LDL 50 mg/L+二苯乙烯苷250μmol/L）、B组 （ox-LDL 50 mg/L+二苯乙烯苷188μmol/L）、C组（ox-LDL 50 mg/L二苯乙烯苷125μmol/L）及D组（ox-LDL 50 mg/L+二苯乙烯苷62.5μmol/L）,每组培养3瓶，重复3次，换成相应的培养液后继续培养细胞48 h后。油红O脂肪染色法观察，测定各组细胞内总胆固醇（total cholesterol, TC）、游离胆固醇（free cholesterol, FC）及培养基上清TC和FC。采用RTPCR检测肝癌HepG2细胞ABCG1、ABCA1和SR-BI mRNA表达水平的变化。

1.3.2 细胞变化按照油红O脂肪染色试剂盒说明书进行染色。吸去培养基，PBS清洗贴壁的细胞3次，ORO Fixative固定10 min，吸去固定液并干燥，ORO Stain液染15 min，加入适量60%异丙醇漂洗30 s并用流水冲洗，苏木精复染2 min，ORO Buffer染1 min，流水冲洗晾干后镜下观察结果。

1.3.3 胆固醇测定室温下2 000 r/min离心5 min后，取各组细胞沉淀和培养基，沉淀需用PBS洗2次后以1×106个细胞加0.1 ml试剂盒配备的裂解液混匀，静置10 min后取上清进行胆固醇测定。用E1015试剂盒和E1016检测沉淀和培养基中TC、FC。取适量上清用BCA法蛋白定量试剂盒（#p1511）测定蛋白浓度，以每毫克蛋白浓度校正上清TC、FC含量，校正上清胆固醇=上清总蛋白/FC浓度×蛋白浓度。应用胆固醇的外流率=培养基TC/（培养基TC+细胞内TC）的方式计算胆固醇的外流率。

1.3.4 总RNA提取及RT-PCR扩增按购买的RNA提取试剂盒说明书和cDNA合成试剂盒的方法进行总RNA提取并合成cDNA链，进行PCR扩增反应，PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，58℃（GAPDH）、60℃（ABCA1、ABCG1）、62℃（SR-BI）退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，72℃继续延伸10 min。取5μl产物进行电泳检测，用BioRad凝胶成像系统观察并拍照记录，最后用GAPDH灰度值对目的基因进行矫正并采用Quantity One软件分析。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二苯乙烯苷在高胆固醇状态下对肝癌HepG2细胞内胆固醇代谢的影响

各组胆固醇情况比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P ＜0.05）；正常组、A、B、C和D组细胞内TC、FC含量均低于模型组（P ＜0.05），同时A、B、C和D组上清TC较模型组升高（P ＜0.05），B、C组上清FC较模型组升高（P ＜0.05）。二苯乙烯苷能够减少HepG2细胞内胆固醇含量，增加胆固醇外流率（P ＜0.05），其中二苯乙烯苷浓度为125μmol/L时达最高值（t =10.094，P =0.000）。见表2和图1。

表2 各组胆固醇情况比较 （±s）

表2 各组胆固醇情况比较 （±s）

注：†与模型组比较，P ＜0.05

组别细胞内TC/（mmol/L）细胞内FC/（mmol/L）上清TC/（mmol/L）上清FC/（mmol/L）胆固醇外流率/%正常组33.49±0.99†17.21±1.78†111.43±6.49†85.52±1.44†76.77±1.55†模型组120.42±1.4546.15±1.83139.21±4.9789.29±1.4453.59±0.76 A组43.91±1.42†25.84±1.32†177.61±6.49†88.98±2.0680.16±0.66†B组75.99±2.85†34.98±1.32†180.87±8.65†94.64±1.13†70.39±0.79†C组37.33±2.18†23.56±1.32†198.85±7.79†89.92±1.13†84.12±0.62†D组43.91±1.42†27.36±2.02†182.51±7.08†87.71±1.5880.59±0.59†F值1 015.091116.23765.97112.269468.170 P值0.0000.0000.0000.0000.000

图1 油红O脂肪染色结果 （×400）

2.2 不同浓度二苯乙烯苷对肝癌HepG2细胞ABCA1、ABCG1和SR-BI mRNA表达的影响

各组ABCA1、ABCG1和SR-BI mRNA表达水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P ＜0.05）。模型组可见各基因条带较细，较弱，进一步两两比较显示，模型组细胞ABCA1 mRNA表达水平较正常组下降（P ＜0.05）。A、B、C和D组ABCA1、ABCG1表达水平较模型组升高（P ＜0.05），A、B和C组SR-BI表达水平较模型组升高（P ＜0.05），A组与B组ABCA1、ABCG1及SR-BI mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（t =1.586、0.221和0.372，P =0.139、0.829和0.716）。见表3和图2～7。

表3 各组ABCA1、ABCG1和SR-BI mRNA表达水平 比较 （±s）

表3 各组ABCA1、ABCG1和SR-BI mRNA表达水平 比较 （±s）

注：†与模型组比较，P ＜0.05

组别ABCA1ABCG1SR-BI正常组1.13±0.11†1.40±0.14†0.76±0.12†模型组0.80±0.110.89±0.130.35±0.12 A组1.24±0.11†1.49±0.13†0.81±0.12†B组1.10±0.11†1.46±0.14†0.84±0.14†C组1.07±0.11†1.22±0.14†0.81±0.12†D组1.04±0.11†1.23±0.15†0.28±0.13 F值5.3907.68912.642 P值0.0080.0020.000

图2 HepG2细胞ABCA1 mRNA的表达

图3 各组ABCA1与GAPDH比值比较 （±s）

图4 HepG2细胞ABCG1 mRNA的表达

图5 各组ABCG1与GAPDH比值比较 （±s）

图6 HepG2细胞SR-BI mRNA的表达

图7 各组SR-BI与GAPDH比值比较 （±s）

3 讨论

高脂血症是指血浆TC或/和甘油三脂（Triglyceride, TG）的异常增高，其是公认的AS发生、发展最重要的原因，AS病变中脂质源于血浆脂蛋白的浸润，主要为FC、胆固醇脂（cholesterol ester, CE），其次为TG、磷脂及载脂蛋白[5]。过多的脂质沉积在动脉膜内，是局部形成隆起的病灶，继而内膜纤维结缔组织增生，将其围起、固定，形成粥样斑块。流行病学调查证明，AS的严重程度随血浆胆固醇水平的升高呈线性加重[5]。

胆固醇外流与多个受体或蛋白参与密切相关[6]。当体内胆固醇过多时，可通过上调ABCA1、ABCG1和SR-BI，增加肝脏胆固醇向胆汁外流[7]。ABCA1、ABCG1和SR-BI是介导细胞胆固醇外流的重要调节蛋白，对调节胆固醇水平起着重要作用[8-10]。ABCA1参与胆固醇外流的最初始的阶段，介导细胞内FC结合到载脂蛋白apoA-I上形成pre-βHDL，接着在卵磷脂-胆固醇脂酰基转移酶（lecithin-cholesterol acyltransferase, LCAT）作用下将结合的FC酯化成CE，从而形成成熟的高密度脂蛋白（High density lipoprotein, HDL）[11]。成熟的HDL在ABCG1介导下继续结合FC，最终形成富含脂质的HDL[12]。富含脂质的HDL转运胆固醇有2条路径：一条是在CETP介导下将自身CE和极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein, VLDL）中的TG进行交换，使VLDL颗粒逐渐变小，密度逐渐增加，最终转变成低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL），进而被肝细胞上的LDL受体识别而入肝，并在肝脏将CE解离出来[13]。继而又从CE中将FC分解出来，这一部分FC经肝细胞上ABCA1介导再次进入血液循环；另一条是富含脂质的HDL直接被肝细胞上的HDL受体SR-BI选择性识别并介导入肝，肝脏将CE解离出来，最终CE中胆固醇转化为粪甾醇类和胆汁酸后外排到胆汁[11]。ABCA1在肝细胞和外周组织细胞都有大量表达，ABCG1主要表达在外周组织细胞，SR-BI主要表达在肝组织细胞[14-16]。ABCA1使肝细胞和外周组织细胞胆固醇流出至apoA-I形成HDL，ABCG1使外周组织细胞胆固醇流出至HDL形成富含脂质的HDL，增加ABCA1或ABCG1的表达能使肝细胞和周围组织细胞流出到HDL的胆固醇增加，降低胆固醇的含量。增加SR-BI表达后，增加其介导HDL流向肝脏同时，也使胆固醇主要以HDL的形式转移至肝，减少了LDL的生成，进而降低LDL被氧化成ox-LDL的量。ABCA1、ABCG1和SR-BI是一个正性调节剂，其高表达可促进胆固醇外流，清除体内过多的胆固醇[17-18]。

ox-LDL是LDL经氧化而成的，是触发AS炎症反应引起AS的关键因子[19-20]。炎症反应贯穿AS的整个过程，与高胆固醇血症共同构成了AS的主要病因[21]。二苯乙烯苷能通过调脂、抗氧化、抗炎、舒张血管及增强免疫力等多靶点多环节，多途径发挥抗AS作 用[2-4]。有研究表明二苯乙烯苷降血脂的同时ox-LDL减少[22]。

本实验以不同浓度的二苯乙烯苷处理高胆固醇HepG2细胞后，发现二苯乙烯苷确有降胆固醇的效果，与模型组相比，ABCG1、ABCA1和SR-BI mRNA表达水平均明显上调。因此笔者认为二苯乙烯苷可能是通过上调ABCG1、ABCA1和SR-BI的表达，增加肝癌HepG2细胞胆固醇的外流，降低胆固醇的 含量。