马文馨，宋 谦，田新会，杜文华

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

青藏高原气候寒冷，自然环境恶劣，植物生长季短，能够适应该地区生长的优质牧草较少，饲草缺乏是制约其畜牧业发展的重要因素，引进高产，稳产和抗寒性强的牧草品种是当前亟待解决的问题[1]。小黑麦(Triticale)是小麦属(Triticum)和黑麦属(Secale)经属间有性杂交，育成的异源多倍体新物种[2]。小黑麦不仅生物量高、营养品质好，而且可以利用冬闲田种植，在冬春枯草季节为家畜提供优质饲料[3]。小黑麦发达的根系对土壤中水分、养分具有较强的吸收能力，因此，可在土层浅薄的坡地和贫瘠的土壤种植[4]。小黑麦耐寒性较强，冬季能够抵御-20℃低温，在2～-10℃条件下能够正常生长，且具有较高生物量[5]。

目前，小黑麦研究多集中于遗传多样性[6]、遗传图谱构建[7]、基因定位[8]、生产性能和营养价值[9-11]等方面，对于小黑麦抗寒性的研究较少。张舒芸[12]测定了小黑麦和黑麦叶片的含水量，可溶性糖含量，SOD，POD，CAT等生理指标，对黑麦和小黑麦抗寒性进行综合评价，结果表明，小黑麦抗寒性显著优于黑麦。刘杰[13]研究了小黑麦对低温复合胁迫的抗逆性，综合评价了小黑麦的抗逆性。以甘农2号小黑麦和小黑麦新品系P4为试验材料，国家草品种审定委员会指定的小黑麦区域试验统一对照石大1号小黑麦(CK1)和中饲1048(CK2)作为对照，通过研究小黑麦材料在低温胁迫处理(0℃、-10℃、-20℃、-30℃)下可溶性糖含量、脯氨酸含量和丙二醛含量，以及SOD，POD和CAT活性的变化，并利用隶属函数法进行综合评价，以评价甘农2号小黑麦的抗寒性强弱，为其在青藏高原高寒牧区和西北、华北的秋闲田种植提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验设在甘肃农业大学牧草试验地。N 36°03′76″，E 103°53′24″，海拔1 600 m，年均温7.9℃，无霜期150 d，年降水量320 mm。土壤类型为黄绵土，土壤有机质2.3 g/kg，碱解氮90.05 mg/kg，速效磷7.36 mg/kg，速效钾172.8 mg/kg，pH 7.35。播种时间为2016年10月26日，前茬作物为小黑麦，有灌溉条件。

1.2 试验材料

参试材料为甘肃农业大学草业学院培育的甘农2号小黑麦品种和小黑麦新品系P4。对照为国家草品种委员会审定的小黑麦品种石大1号(CK1)和中饲1048(CK2)。

1.3 试验设计及方法

试验采取随机区组设计，小区面积2 m×5 m，行距0.3 m，播种深度3～4 cm。播种量按照750万基本苗/hm2计算而得。生长发育期间进行正常灌水施肥，并及时防除杂草。于小黑麦出苗40 d，从其上部采集长势良好的叶片。每个材料取样20 g。将样品放入速封袋，存放在装有液氮的保鲜盒中带回实验室。叶片先用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1遍，然后用吸水纸吸干。将每个小黑麦材料的叶片分为3份，3个重复，用锡箔纸包好分别放入超低温冰箱中进行人工模拟低温处理。处理温度根据甘肃省高寒牧区冬季的最低温，分别为0℃，-10℃，-20℃，-30℃，先在不同温度下处理8h，取出在常温下放置8h，重复3次[14-15]。处理结束后测定叶片的生理指标。

1.4 测定指标与方法

可溶性糖含量用蒽酮比色法测定，游离脯氨酸含量用水合茚三酮法测定，MDA含量用硫代巴比妥酸法测定，SOD活性用氮蓝四唑(NBT)法测定，POD活性采用愈创木酚法测定，CAT活性采用紫外吸收法测定[16-17]。

1.5 数据处理与分析

试验数据采用Excel 2013和SPSS 19.0进行数据处理。抗寒性综合评价应用隶属函数法[18]。生理指标与抗寒性正相关时，用公式：

Uij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

负相关公式：

Uij=1-(Xij-Xjmax)/(Xjmax-Xjmin)

式中：i表示某一小黑麦材料，j表示测定指标，Xij表示某一小黑麦材料第j指标的测定值，Xjmin表示所有小黑麦材料j指标的最小值，Xjmax表示所有小黑麦材料j指标的最大值，Uij表示某一小黑麦材料j指标的抗寒隶属函数值。

2 结果与分析

F测验表明，除小黑麦材料间可溶性糖含量、脯氨酸含量、SOD，POD和CAT活性无显著差异外，低温胁迫间、小黑麦材料间和低温胁迫×小黑麦材料交互作用间的其他生理生化指标均存在极显著差异(P<0.01)，需要进行多重比较(表1)。

表1 小黑麦生理指标的方差分析

注：**表示差异达极显著水平(P<0.01)

2.1 小黑麦材料间生理生化指标的差异

4个参试材料中，P4的MDA含量(0.36 μmol/g)显著高于其他3个材料，甘农2号小黑麦的MDA含量(0.29 μmol/g)和CK1、CK2无显著差异。

2.2 低温胁迫下小黑麦生理生化指标的差异

随着低温胁迫程度的不断增加，小黑麦叶片中的可溶性糖含量先升高后下降， -20℃时可溶性糖含量达到最大值，且显著高于其他低温胁迫处理。低温胁迫处理对小黑麦叶片的脯氨酸含量有极显著影响，-10℃时小黑麦叶片的脯氨酸含量极显著高于其他低温胁迫处理。随着低温胁迫程度加剧，小黑麦叶片的MDA含量呈现出不断升高的变化趋势，-30℃时MDA含量达到最大值，且与其他各处理间的MDA含量均有极显著性差异。-30℃处理下小黑麦叶片的SOD活性显著高于其他低温处理，-10℃处理的SOD活性显著低于0℃处理，但与-20℃处理无显著差异。低温胁迫下小黑麦的POD在-30℃时平均POD活性最大，且与其他各处理间的POD活性均有显著性差异。随着低温胁迫加剧，小黑麦叶片的CAT活性呈现出不断升高的变化趋势，-30℃时大值，且显著高于其他处理。其余处理间的CAT活性无显著差异(表2)。

表2 不同低温胁迫处理下小黑麦的生理指标

注：同行不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.3 小黑麦材料×低温胁迫交互作用间生理生化指标的差异

0℃时，甘农2号小黑麦的可溶性糖含量显著低于P4和CK2；-10℃时，与P4和CK1无显著差异，但显著低于CK2；-20℃和-30℃时显著高于CK1，但显著低于P4和CK2。0℃和-20℃时，甘农2号小黑麦的脯氨酸含量显著低于P4，但显著高于CK1和CK2对照；-10℃时其脯氨酸含量显著低于P4，和CK1和CK2；-30℃时，显著低于P4，与CK1和CK2对照无显著差异。0℃时，甘农2号小黑麦的MDA含量显著低于P4和CK2，与CK1无显著差异；-10℃和-20℃时，甘农2号小黑麦的MDA含量显著低于P4，但显著高于CK1和CK2；-30℃时，其MDA含量显著高于CK2，但低于P4和CK1。0℃和-10℃时，甘农2号小黑麦的SOD活性和P4相近，显著低于CK1和CK2；-20℃时其SOD活性显著高于P4和CK2，但显著低于CK1；-30℃时显著高于CK1和CK2对照，但显著低于P4。0℃时，甘农2号小黑麦的POD活性显著高于CK1和P4，但显著低于CK2；-10℃时其POD活性显著高于P4，但显著低于CK1和CK2；随着低温胁迫加剧，其SOD活性急剧增加，-20℃时显著高于P4和2对照，-30℃时虽然低于P4，但显著高于2对照除-10℃处理下甘农2号小黑麦和P4的CAT活性显著低于CK2外，其余低温胁迫处理下甘农2号小黑麦和P4的CAT活性均显著高于CK1和CK2(图1)。

2.4 小黑麦材料间抗寒性综合评价

利用可溶性糖含量、脯氨酸含量、MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性6个抗寒性指标对4个小黑麦材料的抗寒性进行综合评价，用隶属函数法进行综合评价结果为甘农2号小黑麦>P4>CK1>CK2(表3)。

表3 不同小黑麦材料抗寒性排序

图1 小黑麦材料×低温胁迫交互作用间小黑麦的生理生化指标Fig.1 The physiochemical indexes of the interaction between triticale materials and low temperature stress

3 讨论

3.1 小黑麦材料间生理生化指标的差异

植物在逆境条件下会产生活性氧代谢，破坏植物的组织与功能[19]。随着低温胁迫程度加剧，抗寒性强的材料能积累更多的可溶性糖和脯氨酸[20]。研究中，随着低温胁迫的加剧，小黑麦的可溶性糖含量和脯氨酸含量先增高后降低，CK2的可溶性糖含量最高，P4的脯氨酸含量最高。MDA是植物膜质过氧化作用的主要产物之一，对细胞膜有毒害作用，低温胁迫程度越大，植物积累的MDA越多[21]。植物细胞内的保护酶SOD，POD和CAT可清除植物细胞产生的自由基，使植物细胞的膜系统不被损伤[22]。逆境胁迫下SOD与CAT的变化趋势相似，与抗寒性呈正相关；POD活性变化较复杂，有报道寒冷条件下抗寒品种叶片 POD活性上升或维持较高水平，并随低温胁迫程度增强而增加。抗寒性越强的植物叶片中SOD，POD和CAT活性越大[22-23]。4个参试小黑麦材料的其他指标无显著差异，只有P4的MDA含量显著高于其他3个材料，说明P4的抗寒性最强。

3.2 不同低温胁迫下小黑麦生理生化指标的差异

随着低温胁迫加剧，小黑麦叶片的可溶性糖和脯氨酸含量呈现先升高后降低的趋势，-20℃时可溶性糖最高，-10℃时脯氨酸含量最高，是因为一定程度的低温胁迫有利于提高植物的可溶性糖和脯氨酸含量。但随着胁迫程度加剧植物叶片的组织细胞受到破坏，小黑麦叶片的可溶性糖和脯氨酸含量降低。这与张基德等[24]的研究结果一致。植物受到低温胁迫时，叶片的 MDA含量和POD、SOD、CAT活性会持续上升或维持较高水平以降低伤害[25-26]，试验得出相似结论，即随着低温胁迫程度增强，参试小黑麦材料的MDA含量和POD、SOD、CAT活性呈持续上升的趋势。

3.3 小黑麦材料×低温胁迫交互作用间生理生化指标的差异

可溶性糖通过糖代谢来增加细胞液浓度，增加细胞中的非结冰水，保护植物受到逆境胁迫，抗寒性强的植物可溶性糖含量高[27]。MDA是膜脂过氧化的产物，在逆境胁迫下随着低温胁迫的加剧，细胞的过氧化物会增多，植物体内的MDA含量会增高[28]。SOD，POD和CAT作为细胞的酶保护物质，共同作用清除植物因逆境产生的过多的O2-，防止膜脂过氧化，保护植物细胞受到低温胁迫带来的伤害[29]。试验的参试小黑麦材料受到低温胁迫时，表现各异。0℃和-10℃时CK2的可溶性糖、脯氨酸和MDA含量，以及POD，SOD和CAT活性显著高于甘农2号小黑麦和小黑麦品系P4，但随着胁迫程度加剧，其含量显著低于2材料，说明其难以抵抗-10℃以下的低温，抗寒性较甘农2号小黑麦和小黑麦品系P4弱；从总体分析，CK1的可溶性糖、脯氨酸和MDA含量，以及POD，SOD和CAT活性均低于CK2，说明其抗寒性比CK2弱，这与综合评价的结果一致(表3)。对于甘农2号小黑麦和小黑麦品系P4分析，虽然0℃和-10℃时，和抗寒相关的生理生化指标与CK1和CK2相近或低于对照，但随着低温胁迫程度加剧，各指标迅速上升，表现出较强的抗寒性[30-31]。分析图1结果后发现，0℃和-10℃时CK1和CK2的相关生理生化指标值较高，甘农2号小黑麦和小黑麦品系P4则较低，温度低于-10℃时则相反，因此，4份参试材料在不同低温胁迫下各生理生化指标平均值的差异就缩小，小黑麦材料间除MDA含量外其他生理生化指标就无显著差异(表1)。这一结果进一步说明了小黑麦材料和低温胁迫天数交互作用分析的重要性。由于4份参试小黑麦材料对不同生理生化指标的反应各异，为准确评价其抗寒性强弱。

4 结论

从渗透调节物质、酶保护物质两方面相应指标的变化，基于隶属函数综合评价结果表明，参试小黑麦材料的抗寒性强弱依次为甘农2号小黑麦>P4>CK1>CK2，甘农2号小黑麦和小黑麦新品系P4的抗寒性较强，适宜于甘肃省高寒牧区及其他气候相似区种植，该研究将为高寒牧区饲草品种的选择奠定基础。